本文選題：腸炎沙門菌　切入點(diǎn)：缺失株　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：腸炎沙門菌(Salmonella Enteritidis, SE)是革蘭陰性兼性胞內(nèi)寄生菌,主要寄生在人和動(dòng)物的腸道內(nèi),可引起胃腸炎甚至嚴(yán)重的全身性感染,是重要的人獸共患病病原菌。腸炎沙門菌有周身鞭毛和菌毛,可以運(yùn)動(dòng)。菌毛可以調(diào)節(jié)細(xì)菌與宿主的相互作用,與細(xì)菌的致病性、生物膜的形成、運(yùn)動(dòng)性、黏附和腸道定殖有關(guān),同時(shí)也是腸炎沙門菌中重要的毒力因子之一。在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中,利用SCOTS技術(shù)在篩選和鑒定腸炎沙門菌感染RAW264.7和HD-11巨噬細(xì)胞的過程中發(fā)現(xiàn)：IpfC和stdB基因在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于體外培養(yǎng)狀態(tài),這兩個(gè)基因分別屬于Lpf長(zhǎng)極性菌毛操縱子和Std菌毛操縱子家族,但國(guó)內(nèi)外對(duì)兩基因的功能研究鮮有報(bào)道。本研究利用同源重組的方法成功構(gòu)建了腸炎沙門菌C50041的IpfC、stdB基因缺失株及回復(fù)株,評(píng)價(jià)了缺失株和回復(fù)株的生物學(xué)特性,比較其與野生株在感染細(xì)胞能力、同一家族其它基因表達(dá)量及小鼠致病能力等方面的差異,初步探討了腸炎沙門菌在感染宿主過程中IpfC和stdB基因發(fā)揮的作用。1腸炎沙門菌C50041ΔlpfC和C50041ΔstdB缺失株的構(gòu)建與鑒定本文利用自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組技術(shù)構(gòu)建了腸炎沙門菌C50041株的IpfC和stdB基因缺失株C50041ΔlpfC和C50041AstdB。同時(shí),分別將IpfC和stdB基因克隆至質(zhì)粒pBR322并電轉(zhuǎn)入缺失株中,構(gòu)建了回復(fù)株C50041ΔlpfCR和C50041AstdBR。比較野生株C50041、缺失株C50041ΔlpfC、C50041ΔstdB及回復(fù)株C50041ΔlpfCR和C50041ΔstdBR的基本生物學(xué)特性。生物學(xué)特性分析顯示：IpfC和stdB基因的缺失不影響C50041的生長(zhǎng)特性和生化特性,且兩缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。但是缺失株C50041ΔlpfC對(duì)BALB/c小鼠的LD50是野生株的2倍,缺失株C50041ΔstdB對(duì)BALB/c小鼠的LD50是野生株的三分之一。IpfC基因的缺失使腸炎沙門菌對(duì)BALB/c小鼠的毒力有所降低,而stdB基因的缺失使腸炎沙門菌劉BALB/c小鼠的毒力有所增強(qiáng),這為進(jìn)一步研究腸炎沙門菌Lpf和Std菌毛的功能奠定了基礎(chǔ)。2腸炎沙門菌stdB基因功能的初步研究本研究通過體外細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞因子和菌毛操縱子其它基因表達(dá)量的檢測(cè)及小鼠體內(nèi)細(xì)菌動(dòng)態(tài)分布實(shí)驗(yàn)等開展對(duì)腸炎沙門菌stdB基因的功能初步研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：缺失株對(duì)細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)力沒有影響,但是對(duì)IPEC-J2細(xì)胞黏附和侵襲的能力極顯著減弱(p0.01),同時(shí)驛RAW264.7的侵襲能力有顯著性差異(p0.05)。利用RT-PCR方法發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果和體外感染細(xì)胞RAW264.7試驗(yàn)結(jié)果中缺失株的stdA、stdC和stdF基因表達(dá)量都降低。用C50041、C50041ΔstdB和C50041ΔstdBR分別黏附和侵襲RAW264.7細(xì)胞后,利用RT-PCR方法測(cè)定了炎性因子的表達(dá)量變化,在此過程中IL-12的表達(dá)量都是極顯著性降低(p0.01)。在CBA小鼠動(dòng)物感染模型試驗(yàn)結(jié)果中顯示,缺失株和野生株分別感染CBA小鼠后的腸系膜淋巴結(jié)、派爾氏結(jié)、脾臟、肝臟和盲腸從2.5天到25天的變化規(guī)律幾乎是一致的,在5天時(shí)比較腸系膜淋巴結(jié)的帶菌量有顯著性差異(p0.05)；腸炎沙門菌stdB基因缺失后,可以使其在CBA小鼠盲腸內(nèi)的定殖能力下降。本研究為開展腸炎沙門菌stdB基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。3腸炎沙門菌IpfC基因功能的初步研究本研究通過電鏡觀察、體外細(xì)胞感染、細(xì)胞因子和小鼠體內(nèi)細(xì)菌動(dòng)態(tài)分布等實(shí)驗(yàn),對(duì)腸炎沙門菌定殖、致病、運(yùn)動(dòng)等能力進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：IpfC基因與腸炎沙門菌菌毛的形成有關(guān),缺失株運(yùn)動(dòng)能力和野生株相比有一定程度下降但無(wú)顯著性差異,對(duì)RAW264.7和HD-11兩種巨噬細(xì)胞侵襲能力變?nèi)?對(duì)PEC-J2腸上皮細(xì)胞黏附能力減弱。利用RT-PCR方法發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果和體外感染細(xì)胞RAW264.7試驗(yàn)結(jié)果中缺失株的IpfA、IpfB和IpfD基因表達(dá)量都降低。用C5004、C50041ΔlpfC和C50041ΔlpfCR分別黏附和侵襲RAW264.7細(xì)胞后,利用RT-PCR方法測(cè)定了炎性因子的表達(dá)量變化,缺失株黏附和侵襲RAW264.7細(xì)胞時(shí)IL-12的表達(dá)量都是極顯著性降低(p0.001),IL-6的表達(dá)量只在黏附時(shí)是極顯著性降低(p0.001)。在CBA小鼠動(dòng)物感染模型試驗(yàn)結(jié)果中顯示,在5天時(shí)比較分別感染缺失株和野生株的派爾氏結(jié)帶菌量有顯著性差異(p0.01),缺失株感染后不同監(jiān)測(cè)點(diǎn)派爾氏結(jié)的帶菌都不同程度增多,我們推測(cè)IpfC基因可能與腸炎沙門菌進(jìn)入CBA小鼠的派爾氏結(jié)有關(guān)。同時(shí)腸炎沙門菌IpfC基因缺失后,使腸炎沙門菌在盲腸的定殖能力減弱。本文初步闡明IpfC基因?qū)δc炎沙門菌侵襲宿主及致病性有一定作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61

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本文編號(hào)：1631559