本文選題：豬　切入點(diǎn)：cGAS　出處：《河南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：環(huán)鳥苷-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,cGAS)屬于核苷酸轉(zhuǎn)移酶家族的成員,可以識別胞質(zhì)DNA,并通過合成第二信使環(huán)磷酸鳥苷-腺苷(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate,cGAMP)介導(dǎo)I型干擾素的產(chǎn)生,啟動機(jī)體的先天性免疫反應(yīng)。雖然在人和鼠的細(xì)胞中cGAS作為一種DNA識別受體,可以識別細(xì)胞質(zhì)DNA,催化cGAMP合成,并通過STING(stimulator of interferon genes)依賴的方式活化轉(zhuǎn)錄因子IRF3,促進(jìn)IFN-β的表達(dá)。但豬的cGAS是否也可作為細(xì)胞質(zhì)DNA感受器而觸發(fā)I型干擾素的產(chǎn)生并未見報道。為了對豬cGAS基因進(jìn)行功能鑒定,本研究通過RT-PCR的方法從豬脾臟組織中克隆了cGAS基因片段,對cGAS基因進(jìn)行分析,進(jìn)行了組織表達(dá)譜分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析,并將該片段與pEGFP-N1和p3×Flag-CMV-10載體進(jìn)行連接,構(gòu)建p-cGAS-EGFP和Flag-cGAS載體,然后轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞,在細(xì)胞水平上對p-cGAS進(jìn)行亞細(xì)胞定位,檢測p-cGAS的表達(dá)情況和對IFN-β表達(dá)的影響。通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)對p-cGAS在PRV或poly(dA:dT)/p-cGAS/STING和IRF3/IFN-β通路上進(jìn)行先天性免疫方面的功能鑒定。結(jié)果表明,克隆的豬cGAS的編碼序列長度為1494 bp,編碼497個氨基酸,蛋白質(zhì)分子量為56 kDa,等電點(diǎn)為9.56,其蛋白內(nèi)部有一個Mab-21結(jié)構(gòu)域,并有四個催化中心活性位點(diǎn)。氨基酸序列與牛的相似性最高,為74%。組織表達(dá)譜分析的結(jié)果顯示,在脾臟,十二指腸,空腸,回腸幾個組織表達(dá)量較高,在心、肝等組織中表達(dá)量較低。細(xì)胞亞定位的結(jié)果顯示,豬cGAS主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。過表達(dá)豬cGAS可以通過STING和IRF3依賴的方式促進(jìn)IFN-β的表達(dá),。RNA干擾下調(diào)PK15細(xì)胞p-cGAS后,感染PRV或轉(zhuǎn)染poly(dA:dT),都可使IFN-β的表達(dá)量明顯降低。這些結(jié)果顯示,豬cGAS在PRV和dsDNA誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá)過程中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:鐜笩鑻，

本文編號：1626240