發(fā)布時間：2018-03-17 13:38

  本文選題：通用探針檢測方法　切入點(diǎn)：MicroRNA-155　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：MicroRNA(簡稱miRNA)是一類長約18-22個核苷酸的小分子RNA,它們組成了機(jī)體內(nèi)的RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),可以在多水平控制基因的表達(dá)。參與了細(xì)胞增殖、分化和凋亡的調(diào)控,影響著動物和植物的生長發(fā)育以及各種病理過程。要了解miRNA在機(jī)體生理、病理過程中的表達(dá)情況及其所發(fā)揮的重要作用,就需要有合適的方法對miRNA進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測,從而才能夠開展更為深入的功能性研究。實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)可以對目標(biāo)分子實(shí)現(xiàn)精確定量,是目前一種常用的miRNA檢測手段。本研究在qRT-PCR的基礎(chǔ)上,建立一種靈敏、特異的miRNA通用探針檢測方法,以達(dá)到僅利用一種檢測探針和下游引物實(shí)現(xiàn)對多條miRNA進(jìn)行檢測的目的。布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種嚴(yán)重的人獸共患傳染病,對人類健康和畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了極大危害。布魯氏菌具有多種毒力因子,通過逃避巨噬細(xì)胞的殺傷作用達(dá)到胞內(nèi)生存的目的,與機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)密切相關(guān),其中四型分泌系統(tǒng)(Type IV secretion system,T4SS)是一種重要毒力因子。布魯氏菌借助T4SS將相關(guān)效應(yīng)蛋白或毒素通過細(xì)胞膜分泌到宿主細(xì)胞內(nèi)造成持續(xù)感染,而編碼T4SS的基因受vir B操縱子編碼,所以virB對布魯氏菌的胞內(nèi)生存和毒力具有十分重要的影響。敲除virB啟動子毒力基因可以關(guān)閉T4SS,最終導(dǎo)致突變型存活率降低,不進(jìn)行持續(xù)感染,本實(shí)驗(yàn)即利用了實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存的16M菌株vir B基因缺失株。分別用布魯氏菌16M和16M△virB菌株感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7、建立BALB/c小鼠感染模型,觀察毒力引起的宿主microRNA-155(miR-155)表達(dá)水平變化。最終應(yīng)用通用探針檢測方法,對123例醫(yī)院臨床血清樣本miR-155表達(dá)水平進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。miR-155是一種與免疫相關(guān)的小分子RNA,在多種病原微生物感染后表達(dá)水平均發(fā)生變化,可以參與到病原微生物致病過程。本實(shí)驗(yàn)建立并應(yīng)用通用探針檢測方法,將該方法應(yīng)用于臨床樣本檢測,探討布魯氏菌感染后宿主miR-155的表達(dá)規(guī)律,挖掘miR-155作為診斷布魯氏菌病特征性標(biāo)識的可能性。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下:一、通用檢測方法的建立(1)逆轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)Uni-RT12、Uni-RT12A、Uni-RT12C、Uni-RT12G、Uni-RT12V、Uni-RT12VN共6種逆轉(zhuǎn)錄引物,在人工合成的microRNA-146a(miR-146a)模擬物和臨床血漿樣本中比較各引物的差異。為二者的總RNA加Poly(A)尾,分別用以上6種逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,擴(kuò)增6種逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的miR-146a,擴(kuò)增時使用設(shè)計(jì)的同一種通用探針和通用下游引物。根據(jù)qRT-PCR結(jié)果判斷擴(kuò)增效果。利用高分辨溶解曲線(High-resolution melting,HRM)分析各逆轉(zhuǎn)錄引物特異性,最終篩選出特異性最強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)錄引物。結(jié)果顯示,在檢測實(shí)際樣本時,Uni-RT12A和Uni-RT12VN獲得了較好的效果。進(jìn)一步通過HRM分析,發(fā)現(xiàn)Uni-RT12A的溶解曲線峰值最高,沒有波肩,峰的跨度最小,特異性最好。(2)反應(yīng)體系優(yōu)化利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),選定三因素四水平,具體如下:三個獨(dú)立因素即試劑盒種類、退火溫度和通用探針濃度,試劑盒種類包括GoldStar TaqMan Mixture(Low ROX)、Premix Ex Taq(Probe qPCR)、2×EasyTaq PCR SuperMix和SuperReal PreMix(Probe)。退火溫度分別為62℃、60.7℃、58.4℃和55℃,通用探針濃度分別為0.2μM、0.4μM、0.6μM和0.8μM。在miR-146a模擬物中進(jìn)行L16(4)3正交實(shí)驗(yàn),共16次實(shí)驗(yàn),通過直觀分析法比較各次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明,在使用2×GoldStar TaqMan Mixture、退火溫度為58.4℃、探針濃度為0.6μM時效果最佳。(3)通用探針檢測方法評價通過與實(shí)驗(yàn)室較為常用的SYBR Green I染料法比較,對通用探針法的性能、通用性和擴(kuò)增范圍進(jìn)行評價。性能(特異性和靈敏性)比較:TRIzol法提取10例健康志愿者血漿總RNA制成混合樣本,加Poly(A)尾后分別取不等量產(chǎn)物用于逆轉(zhuǎn)錄,分別用染料法和通用探針法進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增miR-146a、miR-122、miR-155,比較兩種方法的差別。通用性評價:分別用這2種方法擴(kuò)增隨機(jī)挑選的8條miRNA,證明該方法對miRNA普遍適用。擴(kuò)增范圍分析:將已知濃度miR-146a模擬物逆轉(zhuǎn)錄后10倍梯度稀釋,分析該方法的擴(kuò)增范圍。結(jié)果表明,通用探針法特異性和靈敏性均高于染料法,擴(kuò)增范圍0.2μM-0.2×10-4μM,在臨床樣本中可以檢測miR-155、miR-146b、miR-223、miR-181c、miNA-27a、mi R-29a、miR-29b-1、miR-146a共8條miRNA,具有較好通用性。二、布魯氏菌病感染后宿主miR-155表達(dá)規(guī)律研究(1)RAW264.7細(xì)胞侵染實(shí)驗(yàn)用布魯氏菌16M和16M△virB菌株接種小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,陰性對照組接種PBS,在第0、24、和48小時裂解細(xì)胞提取總RNA,分別檢測miR-155表達(dá)水平,采用相對定量(Relative Quantification,RQ)分析miR-155隨時間變化及組間差異。結(jié)果顯示,小鼠巨噬細(xì)胞在感染16M后的24小時,miR-155表達(dá)水平升高,在感染16M△virB后的0至48小時,miR-155表達(dá)水平降低。(2)BALB/c小鼠感染實(shí)驗(yàn)分別用布魯氏菌16M和16M△virB菌株感染BALB/c小鼠,建立小鼠感染模型,以PBS作為陰性對照,在第7、14和28天提取小鼠脾臟總RNA,分別檢測miR-155表達(dá)水平,采用相對定量分析miR-155隨時間變化及組間差異。結(jié)果顯示,小鼠內(nèi)源miR-155表達(dá)水平在感染16M后的7和14天被抑制,但是第28天升高,miR-155表達(dá)水平在感染16M△virB后的7天和14天與16M相反。在第7天時,感染16M△virB后的mi R-155表達(dá)水平明顯高于16M。(3)臨床樣本檢測收集布魯氏菌病患者、非布魯氏菌感染者和健康志愿者血清樣本,分別提取血清總RNA,采用絕對定量(Absolute Quantification,AQ)的方法檢測血清中miR-155表達(dá)水平,分析組間差異,統(tǒng)計(jì)樣本基本信息,分析血清miR-155的表達(dá)水平與抗體滴度和臨床癥狀之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示,布魯氏菌病患者血清miR-155表達(dá)水平與非布魯氏菌感染者和健康志愿者相比被顯著抑制,分析病例信息,血清miR-155表達(dá)水平與布魯氏菌抗體滴度(P0.05)和臨床癥狀(盜汗)(P0.05)明顯相關(guān)。綜上所述,本研究建立了一種miRNA檢測新方法,與SYBR Green I染料法相比特異性高、反應(yīng)靈敏,一次可檢測多條miRNA,在進(jìn)行大量樣本檢測時具有較大優(yōu)勢。將該方法應(yīng)用于醫(yī)院臨床樣本miR-155的檢測中,發(fā)現(xiàn)布魯氏菌病患者與非布魯氏菌病感染者和健康志愿者相比,miR-155表達(dá)水平具有顯著性差異,布魯氏菌病患者血清miR-155與抗體滴度和臨床癥狀(盜汗)呈正相關(guān),提示miR-155可作為布魯氏菌病診斷的一個分子標(biāo)識。在早期感染中,布魯氏菌16M感染細(xì)胞和小鼠后,宿主miR-155表達(dá)水平低于布魯氏菌16M△virB,初步表明布魯氏菌干擾了miR-155介導(dǎo)的宿主免疫應(yīng)答反應(yīng),這種干擾可能與virB或者T4SS有關(guān),具體機(jī)制需要進(jìn)一步探討。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S855.12

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1624977