發(fā)布時間：2018-03-17 07:15

  本文選題：牛支原體　切入點(diǎn)：多克隆抗體　出處：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：牛支原體(Mycoplasma bovis)是一種引起牛呼吸道疾病的病原體,通�？梢砸鸱窝�、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎、角膜結(jié)膜炎等,成為阻礙養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的一大重要隱患。隨著養(yǎng)牛業(yè)的不斷發(fā)展,牛支原體病的流行范圍越來越廣,發(fā)生頻率也越來越高,加之我國對于本病的研究起步較晚,并且國際上尚無公認(rèn)的特異性診斷方法,以及目前對于該病致病機(jī)制的研究尚未達(dá)成共識,從而為該病的預(yù)防控制帶來了不便�；诖�,本研究對牛支原體P48基因進(jìn)行擴(kuò)增,并構(gòu)建原核表達(dá)載體進(jìn)行原核表達(dá),成功制備出P48蛋白單克隆抗體,對P48蛋白相關(guān)功能進(jìn)行了研究,從而為該病原的防控、免疫學(xué)功能及致病機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。同時本研究還建立了牛支原體與無乳支原體等病原的鑒別診斷方法,對牛支原體感染臨床快速、準(zhǔn)確的診斷具有較高的實(shí)用價值。1.牛支原體P48蛋白的原核表達(dá)純化及多克隆抗體的制備參照GeneBank中牛支原體P48株基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,將編碼區(qū)中的五處終止密碼子TGA等義突變?yōu)門GG,將擴(kuò)增獲得的P48基因克隆至表達(dá)載體pET-28a中,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-P48,表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),并在IPTG誘導(dǎo)下成功獲得融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物rMbP48,大小約為51ku。將純化后的表達(dá)產(chǎn)物(His-P48)免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,并通過western blot驗(yàn)證其免疫原性,結(jié)果表明P48抗血清能和純化后的抗原His-P48發(fā)生特異性反應(yīng)。2.牛支原體P48蛋白亞細(xì)胞初步定位為了檢測P48蛋白的分布情況,分別提取牛支原體全菌蛋白、膜蛋白、胞漿蛋白,用制備好的P48抗血清進(jìn)行western blot檢測,結(jié)果表明,P48蛋白在牛支原體的膜蛋白和胞漿蛋白中均有分布,但主要以膜上為主。分別用膜蛋白和胞漿蛋白作為抗原包被后,以制備好的P48抗血清為一抗進(jìn)行ELISA檢測,同時用熒光抗體檢測脂蛋白P48在牛支原體中的分布情況,結(jié)果表明P48蛋白主要存在于牛支原體的膜分離相。全菌免疫熒光試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)脂蛋白P48位于牛支原體的膜表面。3.牛支原體P48蛋白單克隆抗體的制備將純化后的表達(dá)產(chǎn)物(His-P48)免疫BALB/C小鼠制備得到單克隆抗體,成功獲得兩株能夠穩(wěn)定、持續(xù)分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞,細(xì)胞上清效價可達(dá)1:2000左右,單克隆抗體效價可達(dá)1:640 000,與可以引起牛呼吸道疾病的其他病原無交叉反應(yīng),具有穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。4.牛支原體PCR檢測方法的建立根據(jù)P48基因序列特點(diǎn),設(shè)計(jì)了一對特異性引物對牛支原體、無乳支原體、絲狀支原體、滑液支原體、雞毒支原體等基因進(jìn)行擴(kuò)增,并進(jìn)行了敏感性分析,同時對臨洮、武威等地的牛支原體病料及疑似支原體感染病料進(jìn)行相關(guān)處理后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明該引物具有很高的特異性和敏感性,除牛支原體外其他物種基因均無目的條帶出現(xiàn),對牛支原體新鮮臨床病料進(jìn)行PCR擴(kuò)增后有清晰的目的條帶出現(xiàn),說明該診斷方法對于牛支原體的鑒別診斷具有較高的實(shí)用價值。
[Abstract]:Mycoplasma bovis (Mycoplasma bovis) is a kind of bovine respiratory disease caused by the pathogen, usually can cause pneumonia, mastitis, arthritis, keratoconjunctivitis, become one of the important problems that hinder the development of the cattle industry. With the continuous development of the cattle industry, popular more and more widely Mycoplasma disease of cattle, the frequency of occurrence and the more high, coupled with our research on the disease started late, specific diagnosis and there is no international recognized, as well as the current research about the pathogenic mechanism of this disease has not yet reached a consensus, so as to bring inconvenience for the disease prevention and control. Based on this, the study of bovine mycoplasma P48 gene was amplified, and the construction of the original the eukaryotic expression vector of prokaryotic expression, preparation of monoclonal antibodies against P48 protein, the function of P48 protein were studied, so as to control the pathogen, immunological function and pathogenic mechanism research To lay the foundation. At the same time this study also established a method for differential diagnosis of bovine mycoplasma and Mycoplasma agalactiae pathogens, bovine mycoplasma infection clinical rapid, accurate diagnosis has high practical value of.1. bovine mycoplasma P48 prokaryotic expression and purification of protein and preparation of polyclonal antibody to GeneBank in Mycoplasma bovis strain P48 gene sequence design specific primers, five encoding region of the termination codon TGA missense mutation in TGG, the amplification of the P48 gene cloned into expression vector pET-28a, to construct the prokaryotic expression plasmid pET-P48, the recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3), and induced by IPTG fusion protein successfully expressed rMbP48 the size is about 51ku., the purified expression products (His-P48) to immunize New Zealand rabbits to prepare polyclonal antibody, and its immunogenicity was verified by Western blot, and the results show that the P48 antiserum The purified His-P48 antigen specific reaction.2. Mycoplasma bovis P48 protein subcellular distribution of preliminary positioning to the detection of P48 protein, bovine mycoplasma whole bacterial proteins were extracted, membrane protein, Cytoplasmic Protein, P48 antiserum prepared by Western blot test, the results show that the distribution of membrane protein and cytosolic protein P48 protein in Mycoplasma bovis, but mainly in the membrane. With membrane protein and cytosolic protein as antigen, anti ELISA was detected by P48 antiserum was prepared for use at the same time, fluorescent antibody detection of apolipoprotein P48 in Mycoplasma bovis in distribution, results show that the membrane separation P48 protein mainly exists in the whole bacteria Mycoplasma bovis. Immunofluorescence assay further confirmed the lipoprotein P48 of Mycoplasma bovis in bovine mycoplasma.3. membrane surface preparation of monoclonal antibodies against P48 protein purified expression products (H Is-P48) BALB/C mice were immunized with the prepared monoclonal antibody, successfully obtained two strains of hybridoma cells stably, continuously secrete monoclonal antibody, cell supernatant titer was about 1:2000, the monoclonal antibody titer was 1:640 000, and can cause the pathogen of bovine respiratory disease and no cross reaction with high stability, specificity and other characteristics.4. PCR method for detection of Mycoplasma bovis is established according to P48 gene sequence, a pair of specific primers was designed for bovine mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma mycoides, Mycoplasma synoviae, such as poison chicken Mycoplasma gene was amplified, and sensitivity analysis is carried out at the same time, to Lintao, Wuwei and other places of cattle Mycoplasma disease and suspected mycoplasma infection the disease is expected to conduct correlation processing for PCR amplification. The results show that the primer with high specificity and sensitivity, in addition to the bovine mycoplasma species gene was he No target strip appeared. A clear target band appeared after PCR amplification of new Mycoplasma bovis clinical material, indicating that this diagnostic method has high practical value for the differential diagnosis of Mycoplasma bovis.

【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.62

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本文編號：1623709