楊小霞1,張  娟2
（1.青海畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，青海 湟源  812100；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川  753000）

摘要：配制了pH、滲透壓接近的3種精液稀釋液，37 ℃下每隔2 h測(cè)定雞精子活率，直到全部精子死亡為止，計(jì)算精子存活時(shí)間和生存指數(shù)。結(jié)果表明，雞精子在B稀釋液中存活時(shí)間極顯著高于A稀釋液和C稀釋液(P＜0.01)，A、C稀釋液間差異不顯著（P＞0.05）。雞精子在A、B、C 3種稀釋液中存活時(shí)間分別為（12.6±0.5） h、（14.0±0.3） h和（12.1±0.8） h，生存指數(shù)依次為5.7±0.6、6.6±1.7、2.9±0.8, 在A稀釋液和B稀釋液中生存指數(shù)極顯著高于C稀釋液(P＜0.01)，A稀釋液和B稀釋液差異不顯著（P＞0.05）。
關(guān)鍵詞：雞精子；稀釋液；滲透壓；存活時(shí)間
中圖分類號(hào)：S831；S814.3                文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A              文章編號(hào)：1007－273X（２０１３）０7-0012-03

目前在生產(chǎn)上常用的雞精液稀釋液有1%NaCl溶液，5%~7%葡萄糖溶液和葡萄糖卵黃溶液等，但實(shí)踐應(yīng)用效果不理想。精液稀釋液各項(xiàng)指標(biāo)是影響精子存活時(shí)間和生存指數(shù)的重要因素，尤其是稀釋液的pH值、滲透壓對(duì)精子生存指數(shù)的影響很大。盡管大量研究者對(duì)雞精液稀釋液的研究取得了很大進(jìn)展，但如何根據(jù)雞精子在體外生理特點(diǎn)和變化規(guī)律，研制出配方簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，易于推廣應(yīng)用的常溫、低溫、冷凍的家禽精液稀釋液，還有待進(jìn)一步的研究。陳元明等［1］研究認(rèn)為雞精子在2~5 ℃條件下可存活10 d，而在30 ℃以上則只能存活數(shù)小時(shí)。本試驗(yàn)制備了3種稀釋液,將采集的雞新鮮精液進(jìn)行稀釋后，37 ℃下每隔2 h觀察一次精子活率，測(cè)定精子存活時(shí)間、生存指數(shù)等指標(biāo)，以期了解提高溫度后稀釋液對(duì)雞精液保存效果的影響。
1  材料與方法
1.1  材料
1.1.1  試驗(yàn)用雞  30只14月齡蛋用型羅曼種公雞為青海省畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院養(yǎng)禽示范園飼養(yǎng)。
1.1.2  試劑  葡萄糖、果糖、氯化鎂、谷氨酸鈉、醋酸鈉、檸檬酸鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、EDTA-Na2、N-三（羥甲基）甲基-2-氨基乙烷磺酸（TES）、超純水等。
1.1.3  儀器  精子質(zhì)量評(píng)定系統(tǒng)、電子分析天平、滲透壓儀、貝克曼溫度計(jì)、數(shù)字pH計(jì)、普通溫度計(jì)、顯微鏡、數(shù)顯恒溫水浴鍋、集精杯等。
1.2  方法
1.2.1  稀釋液的制備  雞精液稀釋液配方見表1，按配方準(zhǔn)確稱取所用試劑，溶解定容后用定性濾紙過濾，分裝在250 mL瓶中，100 ℃高溫高壓滅菌15 min，，室溫冷卻后蠟封，陰涼處保存?zhèn)溆谩?br /> 1.2.3  精液的稀釋與保存  供試精液來自30只蛋用型羅曼種公雞，公雞經(jīng)采精訓(xùn)練，采用背腹聯(lián)合按摩法采集精液，并進(jìn)行品質(zhì)評(píng)定。將無糞尿污染精液混合，當(dāng)活率大于0.6時(shí)供稀釋保存之用。將采集的混合鮮精液與各稀釋液按精液∶稀釋液（V/V）1∶4等溫稀釋，分裝于潔凈的青霉素空瓶中，加蓋后放入37 ℃恒溫水浴鍋中，保存觀察。1.2.4  測(cè)定指標(biāo)與方法  精子活率每隔2 h觀察一次，檢測(cè)時(shí)間與結(jié)果記入專用表格，直到全部精子死亡為止，最后計(jì)算精子存活時(shí)間和生存指數(shù)。過程中始終注意保存溫度的恒定與無菌操作，試驗(yàn)重復(fù)4次。
1.2.5  滲透壓及pH的測(cè)定  采用冰點(diǎn)下降法測(cè)定各稀釋液的冰點(diǎn)下降度（Δt），按Δt/1.86×1 000換算為滲透摩爾濃度；使用PHS-2型酸度計(jì)測(cè)定各稀釋液的pH。
1.2.6  數(shù)據(jù)處理  4次試驗(yàn)結(jié)果取平均值，計(jì)算每組數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)誤，并進(jìn)行了方差分析。
2   結(jié)果與分析
    3種稀釋液滲透壓和pH測(cè)定結(jié)果見表2。
    3種稀釋液37℃下保存精液時(shí)精子存活時(shí)間與生存指數(shù)見表3，生存指數(shù)是指相鄰兩次精子活率均數(shù)與間隔時(shí)間乘積的總和。雞精子在B稀釋液中存活時(shí)間極顯著高于A稀釋液和C稀釋液(P＜0.01)，A、C稀釋液間差異不顯著（P＞0.05）。雞精子在A、B、C 3種稀釋液中存活時(shí)間分別為（12.6±0.5）h、（14.0±0.3）h和（12.1±0.8）h，生存指數(shù)依次為5.7±0.6、6.6±1.7、2.9±0.8, 在A稀釋液和B稀釋液中生存指數(shù)極顯著高于C稀釋液(P＜0.01)，A稀釋液和B稀釋液差異不顯著（P＞0.05）。
3  小結(jié)與討論
3.1  釋液液組成對(duì)精子保存的影響
    稀釋液保存效果與稀釋液組成有著密切的關(guān)系。本試驗(yàn)保存效果較好的A稀釋液和B稀釋液選擇果糖、谷氨酸鈉、氯化鎂、檸檬酸鉀等，在家禽稀釋液中添加果糖效果要優(yōu)于葡萄糖，并證實(shí)精子分解果糖速度較緩慢。張兆旺［2］研究結(jié)果顯示，果糖稀釋液中精子生存指數(shù)、存活時(shí)間和畸形率均優(yōu)于蔗糖，葡萄糖效果最差。蘇東頓等［3］也認(rèn)為果糖是提高貯存精液受精能力的重要成分之一。
    Harrison［4］研究認(rèn)為谷氨酸鹽能延長(zhǎng)雞體外精子壽命。張兆旺［5］認(rèn)為谷氨酸鈉對(duì)精子有保護(hù)作用，并指出谷氨酸鈉在單獨(dú)配制稀釋液時(shí)以每100 mL含2.40~2.47 g為宜。張兆旺等［6］報(bào)道表明在葡萄糖-磷酸鹽類雞精液稀釋液中添加谷氨酸鈉優(yōu)于檸檬酸鈉。張堅(jiān)中等［7］認(rèn)為稀釋液中含有果糖、谷氨酸鈉、檸檬酸鈉和適量的K+、Mg2+能延長(zhǎng)雞精子壽命，同時(shí)還指出在鹽成分上，檸檬酸鈉優(yōu)于氯化鉀。適量的K+是維持精子正常機(jī)能所必需的，Mg2+具有保護(hù)精子運(yùn)動(dòng)和延長(zhǎng)其壽命的機(jī)能。本試驗(yàn)中C稀釋液保存效果較差可能是因?yàn)榕浞街羞x擇了葡萄糖以及缺少適量的K+離子，從而影響了精子的存活時(shí)間。
3.2  稀釋液pH對(duì)精子保存的影響
    研究顯示，保存效果最好的雞精液稀釋液pH為6.8～7.2，此時(shí)受精率顯著高于pH 5.8~6.2［8］。本試驗(yàn)中A、B和C3種稀釋液的pH分別為7.0、6.9和7.3。由于精子代謝旺盛，能量消耗較快，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物迅速積累，從而改變了pH，抑制了某些酶的活性，使精子喪失受精能力，故雞精液稀釋液pH要控制在一定范圍之內(nèi)。陳理盾等［9］觀察了 9 種稀釋液 pH對(duì)精子存活時(shí)間、生存指數(shù)的影響，其優(yōu)等液 pH 6.7，精子存活時(shí)間 264 h，活率大于 0.6 的存活時(shí)間 148 h，pH范圍在 6.7~7.2 的4 種良等液的保存效果達(dá)到了北京家禽稀釋液（BJJX）的水平。李尚仁等［10］在雞精液冷凍保存試驗(yàn)中，對(duì)精液稀釋液進(jìn)行了篩選，結(jié)果效果最好的稀釋液pH為7.0，平均凍后活力達(dá)0.526。從以上試驗(yàn)結(jié)果可以看出,無論雞精液是常溫還是低溫保存，欲使雞精液保存效果好,稀釋液的pH應(yīng)與其生理范圍盡量接近。
3.3  稀釋液滲透壓對(duì)精子保存的影響
    滲透壓是雞精液稀釋液的重要參數(shù)之一，在雞人工授精中，人們?yōu)閷ふ蚁♂屢鹤罴训臐B透壓進(jìn)行了大量的研究。本試驗(yàn)中A、B、C 3種稀釋液的滲透壓分別為318、327、307 mOs/kg，與雞的精子生存較為適宜的稀釋液滲透壓（278~434 mOs/kg）相近。但李尚仁等［10］認(rèn)為適宜滲透壓是411~447 mOs/kg，陳元明等［1］指出在300~400 mOs/kg時(shí)為宜，同時(shí)30 ℃保存試驗(yàn)證明雞精液隨著稀釋液滲透壓的升高或降低，精子生存指數(shù)下降，而與雞精液滲透壓相近或偏高的稀釋液中精子活力最好，存活時(shí)間最長(zhǎng)。
    雞精液稀釋液能夠?yàn)榫犹峁┠芰�，保證適合雞精子生存的pH環(huán)境，維持適當(dāng)?shù)臐B透壓和電解質(zhì)平衡，中和緩解精子和微生物代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)，沖淡精清中有害因子的濃度，延長(zhǎng)精子在體外存活的時(shí)間，從而提高母雞受精率。所以在稀釋液配方物質(zhì)的選擇上應(yīng)該綜合考慮以上各種因素。
4  結(jié)論
（1）3種配方稀釋液在37℃下保存效果較好的為B液，其次為A液，而C液保存效果較差。
    （2）配方中添加果糖、檸檬酸鉀能夠提高精子生存指數(shù)。
    （3）如果溶劑質(zhì)量得不到保證，可以在配方中加入少量EDTA-Na2，能夠保證稀釋液清亮和保存效果。
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