本文選題：喹賽多　切入點(diǎn)：生長(zhǎng)發(fā)育　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：喹賽多是抗菌促生長(zhǎng)作用較好的一種喹VA啉類藥物,其對(duì)動(dòng)物機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生重要影響,適合用于食品動(dòng)物的養(yǎng)殖業(yè)。雖然目前已有大量關(guān)于喹賽多藥理學(xué)機(jī)制的研究,但是喹賽多促生長(zhǎng)作用的分子機(jī)制仍然不是很清楚。前期已經(jīng)從喹賽多作用下基因的表達(dá)、蛋白和激素的分泌、表型的變化等方面進(jìn)行了研究,但是由于生物體是一個(gè)復(fù)雜的體系,其生長(zhǎng)受到很多因素的影響,為了更好的說(shuō)明喹賽多促生長(zhǎng)作用仍需從多方面進(jìn)一步研究。表觀遺傳學(xué)變化主要是指遺傳物質(zhì)的修飾,如DNA的甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑等,這些遺傳物質(zhì)的修飾可以通過(guò)影響基因的啟動(dòng)來(lái)對(duì)基因的表達(dá)變化產(chǎn)生調(diào)控,進(jìn)而對(duì)機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育產(chǎn)生影響。那么喹賽多作用于細(xì)胞后是否可以引起機(jī)體表觀遺傳學(xué)變化?喹賽多是否可以通過(guò)影響表觀遺傳學(xué)變化進(jìn)而影響機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育?答案是未知的,仍需進(jìn)一步研究。在動(dòng)物機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,內(nèi)分泌系統(tǒng)起著極其重要的作用,其中IGF-1(Insulin-like Growth Factor-1)是機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的物質(zhì),而肝臟不但是IGF-1的主要分泌器官,而且還是各種不同藥物與機(jī)體直接接觸及在體內(nèi)進(jìn)行代謝的主要器官。為了進(jìn)一步揭示喹賽多的促生長(zhǎng)作用機(jī)理,本課題以重組生長(zhǎng)激素(rGH)為對(duì)照藥,以基因IGF-1為切入點(diǎn),以大鼠的肝細(xì)胞(BRL細(xì)胞)為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行相應(yīng)的表觀遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)。1.喹賽多于BRL細(xì)胞時(shí)間和劑量的確定(篩選對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)最有利的條件)本課題采用MTT法,以細(xì)胞線粒體內(nèi)產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶(SDH)的含量為指標(biāo),檢測(cè)藥物作用下細(xì)胞的活力,并結(jié)合細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和IGF-1 mRNA表達(dá)量來(lái)確定喹賽多和對(duì)照藥物rGH作用于BRL細(xì)胞的時(shí)間和劑量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,1μmol/L的喹賽多和0.163×2-8 IU/ml的rGH分別作用于BRL細(xì)胞4 h后細(xì)胞中SDH的含量相對(duì)較高,且細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況良好,基因IGF-1 mRNA表達(dá)水平上調(diào)明顯,且與生長(zhǎng)相關(guān)的基因GHR mRNA表達(dá)水平和IGF-1R mRNA表達(dá)水平也上調(diào)明顯,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育有利,由此確定可以用1μmol/L的喹賽多和0.163×2-8 IU/m L的rGH分別作用于BRL細(xì)胞4 h進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。2.喹賽多對(duì)BRL細(xì)胞內(nèi)DNA甲基化的影響用1μmol/L的喹賽多和0.163×2-8 IU/mL的r GH(對(duì)照藥)分別作用于BRL細(xì)胞4h,發(fā)現(xiàn)喹賽多和rGH都可以引起B(yǎng)RL細(xì)胞基因組DNA甲基化水平增加,不利于某些基因的表達(dá),而且BRL細(xì)胞基因組DNA甲基化水平會(huì)隨著喹賽多劑量的增加而改變,不會(huì)隨著時(shí)間的改變而發(fā)生變化。用BSP法檢測(cè)基因IGF-1啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平卻發(fā)現(xiàn)1μmol/L的喹賽多和0.163×2-8 IU/m L的rGH分別作用于BRL細(xì)胞4 h后可以引起基因IGF-1啟動(dòng)子區(qū)域大部分CpG位點(diǎn)甲基化水平降低,這一現(xiàn)象是有利于轉(zhuǎn)錄因子與基因IGF-1啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物,有利于基因IGF-1的轉(zhuǎn)錄,促使IGF-1 mRNA表達(dá)水平增加。通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)DNA甲基化水平的變化可能與DNA甲基化相關(guān)酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B有關(guān),可能是藥物通過(guò)影響DNA甲基化相關(guān)酶的變化進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)的DNA甲基化水平。3.喹賽多對(duì)BRL細(xì)胞內(nèi)組蛋白修飾(H3K4me3和H3K27ac)的影響細(xì)胞內(nèi)組蛋白H3K4me3修飾水平和H3K27ac修飾水平與基因的轉(zhuǎn)錄水平有關(guān),對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生重要影響。研究發(fā)現(xiàn)喹賽多和rGH都可以引起B(yǎng)RL細(xì)胞內(nèi)H3K4me3修飾水平和H3K27ac修飾水平明顯降低,且在0~4 h內(nèi)隨著細(xì)胞與藥物接觸時(shí)間的增加,BRL細(xì)胞內(nèi)H3K4me3修飾和H3K27ac修飾水平逐漸降低,這一現(xiàn)象對(duì)某些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是不利的。通過(guò)ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),喹賽多和rGH都可以引起B(yǎng)RL細(xì)胞內(nèi)基因IGF-1啟動(dòng)子區(qū)域H3K4me3修飾和H3K27ac修飾水平明顯增加,促進(jìn)IGF-1 m RNA表達(dá)水平。而且研究發(fā)現(xiàn)這些組蛋白H3K4me3修飾水平和H3K27ac修飾水平的增減可能與H3K4me3修飾酶和H3K27ac修飾酶密切相關(guān)。4.喹賽多對(duì)BRL細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響為了進(jìn)一步觀察喹賽多和對(duì)照藥rGH作用于BRL細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響,我們以細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)上組蛋白H3K4me3修飾和H3K27ac修飾為參照,結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察喹賽多和對(duì)照藥物rGH對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),BRL細(xì)胞在喹賽多和對(duì)照藥物rGH作用下BRL細(xì)胞核中可見(jiàn)空間變小,染色質(zhì)之間的空隙變得更大。添加抑制劑5-氮雜-2脫氧胞嘧啶核苷后,與喹賽多處理組和rGH處理組相比,細(xì)胞中細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)空間變大,細(xì)胞中染色質(zhì)之間的空隙變得更小。由此可以推測(cè)BRL細(xì)胞在喹賽多和rGH作用下染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,變得更加疏松,有利于轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成,可能更有利于基因(如基因IGF-1)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。通過(guò)對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行分析,可知:第一,喹賽多和rGH都可能通過(guò)調(diào)控DNMTs影響細(xì)胞內(nèi)DNA甲基化程度,一方面,引起B(yǎng)RL細(xì)胞內(nèi)基因組DNA甲基化水平增加,抑制某些基因表達(dá),另一方面,卻可以引起基因IGF-1啟動(dòng)子區(qū)域大部分CpG位點(diǎn)甲基化水平降低,促進(jìn)基因IGF-1 mRNA表達(dá);第二,喹賽多和rGH都可能通過(guò)影響H3K4me3修飾酶和H3K27ac修飾酶,引起B(yǎng)RL細(xì)胞內(nèi)H3K4me3修飾水平和H3K27ac修飾水平在0~4 h逐漸降低,抑制某些基因的表達(dá),但是卻可以引起基因IGF-1啟動(dòng)子區(qū)域H3K4me3修飾水平和H3K27ac修飾水平明顯增加,促進(jìn)基因IGF-1的轉(zhuǎn)錄;第三,BRL細(xì)胞在喹賽多和rGH作用下,染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得更加疏松,有利于轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成,可能更有利于基因(如基因IGF-1)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。本研究首次從表觀遺傳學(xué)變化的多個(gè)方面,以rGH為對(duì)照藥,以細(xì)胞整體水平及單個(gè)基因IGF-1為切入點(diǎn),探究喹賽多是否可以引起表觀遺傳學(xué)變化及這些表觀遺傳學(xué)變化與生長(zhǎng)發(fā)育之間的關(guān)系,為進(jìn)一步說(shuō)明喹賽多的促生長(zhǎng)作用機(jī)理提供理論依據(jù),而且本研究也為抗生素促生長(zhǎng)作用的研究提供思路和參考。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S859.79

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1606869