發(fā)布時(shí)間：2018-02-27 00:09

  本文關(guān)鍵詞： 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒 SPF雛雞 miRNA 高通量測(cè)序　出處：《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(reticuloendotheliosis,RE)是由禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(reticuloendotheliosis virus,REVs)引起的禽類的一種傳染性致瘤性疾病。REV主要引起患禽的生長(zhǎng)遲緩綜合征、免疫抑制及慢性腫瘤。該病毒自1958年首次被分離出來(lái)以后,在世界許多國(guó)家和地區(qū)均有RE發(fā)生或流行的報(bào)道,我國(guó)于1986年在南京首次分離出該病毒。REV主要感染雞、火雞、鴨、孔雀、鵪鶉、鷓鴣、雉和珍珠雞等,其中對(duì)REV最易感的動(dòng)物是火雞,而雞是實(shí)驗(yàn)室主要研究對(duì)象。該病毒的主要傳播方式為水平傳播,其他傳播方式還有垂直傳播、蟲(chóng)媒傳播以及環(huán)境污染物傳播等。該病毒的廣泛傳播會(huì)造成多種病毒疫苗免疫失效以及降低動(dòng)物機(jī)體免疫機(jī)能從而使其他生物性致病因素,尤其是其他病毒更易感染,進(jìn)而造成多種病毒的混合感染,導(dǎo)致病雞大量死亡,給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大損失。本研究以SPF雛雞為研究對(duì)象,在成功建立SPF雛雞網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒感染動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上,采用高通量測(cè)序以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法,通過(guò)對(duì)REV感染SPF雛雞法氏囊組織中差異表達(dá)的miRNA以及其相關(guān)靶基因mRNA表達(dá)等主要指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化的檢測(cè),并結(jié)合REV感染SPF雛雞臨診癥狀,較全面系統(tǒng)的研究了患RE的SPF雛雞上述被檢指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化及其對(duì)細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響。旨在揭示REV感染SPF雛雞對(duì)miRNA表達(dá)的影響,同時(shí)研究REV對(duì)感染雛雞法氏囊細(xì)胞凋亡及腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的作用,研究主要結(jié)果如下:1.REV感染SPF雛雞疾病模型的建立本研究通過(guò)腹腔注射途徑,使1日SPF齡雛雞感染REV,并經(jīng)感染雛雞臨診癥狀的分析、眼觀病理變化的觀察以及PCR檢測(cè)等多種手段對(duì)雛雞是否成功感染REV進(jìn)行判斷。結(jié)果發(fā)現(xiàn),腹腔注射REV病毒液后,實(shí)驗(yàn)雛雞較相應(yīng)對(duì)照雛雞精神狀態(tài)萎靡,背羽凌亂且稀少、進(jìn)食量明顯減少,體重較同日齡的對(duì)照雞顯著減輕,表現(xiàn)出典型的生長(zhǎng)抑制綜合征的癥狀;剖檢實(shí)驗(yàn)雛雞可發(fā)現(xiàn),其法氏囊和胸腺等免疫器官體積明顯縮小;然后,再通過(guò)PCR對(duì)實(shí)驗(yàn)雛雞法氏囊組織進(jìn)行病毒檢測(cè),結(jié)果在實(shí)驗(yàn)雛雞法氏囊中成功擴(kuò)增出REV的特異性保守序列LTR,而同日齡的對(duì)照雛雞則未擴(kuò)增出該基因。以上各項(xiàng)被檢指標(biāo)均證明通過(guò)對(duì)易感動(dòng)物SFP雛雞進(jìn)行腹腔注射REV液后,可成功復(fù)制出RE雛雞模型。2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)REV方法的建立及其應(yīng)用迄今為止,已經(jīng)報(bào)道了多種對(duì)REV的檢測(cè)方法,主要包括普通PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、間接免疫熒光以及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等方法。這些檢測(cè)方法各有其優(yōu)勢(shì),但也有不足之處。本研究根據(jù)REV的LTR基因保守序列建立了熒光定量PCR檢測(cè)方法,通過(guò)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)其最適退火溫度為57℃,相關(guān)系數(shù)為R2=0.996753,回歸方程:y=32.311-3.142x。應(yīng)用上述建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法,對(duì)REV感染SPF雛雞后第21天和第28天患病雛雞胸腺、脾臟和法氏囊中病毒含量進(jìn)行檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn),在REV感染SPF雛雞后第21天和第28天患病雛雞在胸腺、脾臟囊和法氏囊中均可檢測(cè)到病毒的LTR基因;同時(shí),法氏囊中病毒含量顯著高于胸腺和脾臟,而胸腺和脾臟中病毒含量未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.REV感染SPF雛雞法氏囊細(xì)胞的miRNA高通量測(cè)定本研究通過(guò)高通量檢測(cè)技術(shù),對(duì)REV感染SPF雛雞后第21天和28天,其法氏囊中miRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)數(shù)據(jù)質(zhì)量分析發(fā)現(xiàn),檢測(cè)的各組樣品序列長(zhǎng)度為0.597G-0.776G,錯(cuò)誤率均為0.01%,四組數(shù)據(jù)中Q20均高于98%,Q30均高于97%,均高于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。GC含量均在50%左右,不會(huì)影響測(cè)序的進(jìn)行。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾,去除了基因組中影響數(shù)據(jù)質(zhì)量的結(jié)果后得到的clean reads占總reads的85%以上,并且map到參考基因組的clean reads占總reads的82%以上,以上均說(shuō)明本次測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù)質(zhì)量良好,可信度較高。對(duì)map上的clean reads進(jìn)行差異表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)SPF雛雞感染REV后第21天有63個(gè)miRNA表達(dá)量發(fā)生顯著變化,其中有30個(gè)miRNA表達(dá)量上調(diào),有33個(gè)表達(dá)量下調(diào);在REV感染SPF雛雞后第28天有25個(gè)miRNA表達(dá)量發(fā)生顯著變化,其中有8個(gè)miRNA表達(dá)量上調(diào),有17個(gè)miRNA表達(dá)量下調(diào)。4.高通量測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證應(yīng)用熒光定量PCR方法對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證性檢測(cè),分別隨機(jī)選取了REV感染SPF雛雞后第21天和第28天的10個(gè)上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)miRNA,并檢測(cè)了其表達(dá)量,并通過(guò)相關(guān)性分析對(duì)比發(fā)現(xiàn),REV感染后第21天和28天實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的10個(gè)差異表達(dá)miRNA表達(dá)量與高通量測(cè)序結(jié)果表達(dá)量呈正相關(guān),其相關(guān)性系數(shù)分別為:R2=0.9633和0.9796。證明高通量測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確。5.REV感染引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究在REV感染SPF雛雞后第21天,其法氏囊出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,檢測(cè)出此時(shí)差異表達(dá)miRNA靶基因Caspase-6,Caspase-7和P27表達(dá)量顯著升高,而Mcl-1表達(dá)量顯著降低,Caspase-6和Caspase-7被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡通路的關(guān)鍵性因子,同時(shí)抑瘤蛋白P27也具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用,均為促凋亡因子,其表達(dá)量升高證明細(xì)胞凋亡過(guò)程被促進(jìn);而B(niǎo)cl家族成員Mcl-1具有抑制凋亡的作用,是典型的抑凋亡因子,其表達(dá)量降低也說(shuō)明細(xì)胞凋亡受到促進(jìn)。同時(shí)對(duì)靶基因及其調(diào)控miRNA表達(dá)量進(jìn)行負(fù)相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)其具有顯著的負(fù)相關(guān)性,其負(fù)相關(guān)系數(shù)為:R2=0.9533,證明miRNA對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因具有調(diào)控作用。以上結(jié)果顯示,REV通過(guò)調(diào)控miRNA表達(dá)促進(jìn)促凋亡因子m RNA的表達(dá),同時(shí)抑制抑凋亡因子表達(dá)來(lái)引起法氏囊細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。6.REV感染對(duì)腫瘤相關(guān)靶基因的影響在SPF雛雞感染REV后第28天,檢測(cè)出差異表達(dá)miRNA的靶基因CCNA1、CCNB2、CCND3和c-myc的表達(dá)量均有不同程度的上調(diào),CCNA1、CCNB2和CCND3均為不同亞型的細(xì)胞周期素蛋白,分別在細(xì)胞分裂間期發(fā)揮促進(jìn)作用,能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,一般在分裂旺盛的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量較高;c-myc為原癌基因,其表達(dá)量升高能夠證明腫瘤的發(fā)生或具有明顯的發(fā)生趨勢(shì),同時(shí)對(duì)上述基因及其miRNA進(jìn)行負(fù)相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)其負(fù)相關(guān)性系數(shù)為:R2=0.9533,說(shuō)明兩者具有顯著的負(fù)相關(guān)性。以上結(jié)果顯示REV通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期素蛋白的表達(dá)、以及激活原癌基因來(lái)促進(jìn)癌癥的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S858.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1540269