本文關(guān)鍵詞： 牦牛 絨毛 角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 原核表達(dá)　出處：《西北民族大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：牦牛以全身密生長(zhǎng)毛及絨毛而得名,是唯一產(chǎn)絨的牛種,天祝白牦牛是特有的產(chǎn)白色絨毛的品種,由于白色絨毛有利于染色,因此降低了紡織業(yè)中染色的難度。角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(KAP)作為主要的絨毛蛋白,在絨毛的生長(zhǎng)中起著重要作用。本試驗(yàn)旨在通過(guò)研究KAP家族蛋白為篩選控制絨毛生長(zhǎng)的主效基因奠定一定的基礎(chǔ)。該研究選取了KAP家族的四個(gè)基因KAP1.1, KAP3.1,KAP11.1和KAP13.1作為研究對(duì)象。根據(jù)相應(yīng)的四個(gè)基因在Genbank中尋找報(bào)道的黃牛的序列設(shè)計(jì)它們的引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增的手段得到這四個(gè)基因的目的片段,運(yùn)用TA克隆技術(shù)獲得其完整編碼區(qū)(CDS)序列并使用生物信息學(xué)軟件對(duì)基因進(jìn)行分析。將克隆得到的目的片段轉(zhuǎn)入表達(dá)載體并用大腸桿菌(E.coil)表達(dá)蛋白質(zhì)。運(yùn)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)天祝白牦牛KAP家族基因在絨毛生長(zhǎng)期和休止期皮膚組織中這四個(gè)基因之間的表達(dá)差異。研究結(jié)果如下：(1)通過(guò)TA克隆得到了KAP1.1,KAP3.1, KAP11.1口KAP13.1基因的完整CDS區(qū)序列。KAPl.1基因完整的編碼區(qū)長(zhǎng)度為501bp,所編碼的蛋白質(zhì)含有166個(gè)氨基酸；該蛋白屬于親水性蛋白,含有High sulphur keratin-associated protein家族蛋白的完整結(jié)構(gòu)域,共含有6個(gè)磷酸化位點(diǎn),該蛋白在線粒體上發(fā)揮生物學(xué)作用,二級(jí)結(jié)構(gòu)含有α螺旋,延伸鏈,p轉(zhuǎn)角,無(wú)規(guī)卷曲四種結(jié)構(gòu)；KAP3.1基因完整的編碼區(qū)長(zhǎng)度為297bp,所編碼的蛋白質(zhì)含有98個(gè)氨基酸,該蛋白屬于親水性蛋白,含有Keratin, high sulphur matrix protein家族蛋白的結(jié)構(gòu)域,共含有5個(gè)磷酸化位點(diǎn),該蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮生物學(xué)作用,二級(jí)結(jié)構(gòu)含有延伸鏈,p轉(zhuǎn)角,無(wú)規(guī)卷曲三種結(jié)構(gòu)；KAP11.1基因完整的編碼區(qū)長(zhǎng)度為480bp,所編碼的蛋白質(zhì)含有159個(gè)氨基酸,該蛋白屬于親水蛋白,含有完整的Keratin-associated protein家族蛋白的結(jié)構(gòu)域,共含有18個(gè)磷酸化位點(diǎn),該蛋白在線粒體上發(fā)揮生物學(xué)作用,二級(jí)結(jié)構(gòu)含有延伸鏈,無(wú)規(guī)卷曲兩種結(jié)構(gòu)；KAP13.1基因完整的編碼區(qū)長(zhǎng)度為495bp,所編碼的蛋白質(zhì)含有164個(gè)氨基酸,該蛋白屬于親水蛋白,共含有25個(gè)磷酸化位點(diǎn),該蛋白在細(xì)胞核上發(fā)揮生物學(xué)作用,含有完整的Keratin-associated protein家族蛋白的結(jié)構(gòu)域,二級(jí)結(jié)構(gòu)含有延伸鏈,β轉(zhuǎn)角,無(wú)規(guī)卷曲三種結(jié)構(gòu)。(2)將pET28a質(zhì)粒載體和KAP家族基因結(jié)合形成原核表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)其在原核生物大腸桿菌的表達(dá)。通過(guò)SDS-PAGE分析結(jié)果顯示KAP1.1、KAP3.1、KAP11.1以及KAP13.1的目的片段大小與預(yù)期一致；通過(guò)Western Blot方法發(fā)現(xiàn)目的片段有放射性反應(yīng),證明抗體與目的片段結(jié)合,從而驗(yàn)證了SDS-PAGE分析結(jié)果的正確性,通過(guò)以上試驗(yàn)證明得到的蛋白是KAP家族蛋白,并證明了克隆得到的基因是目的基因,得到了蛋白樣本,為后續(xù)試驗(yàn)提供樣本支持。(3)運(yùn)用Real-time PCR技術(shù)對(duì)KAP家族基因在天祝白牦牛絨毛生長(zhǎng)期和休止期的表達(dá)量進(jìn)行分析,在生長(zhǎng)期KAP家族基因除KAP1.J1和KAP13.1之間沒(méi)有顯著性差異外(P≥0.05),其他基因之間都有極顯著性差異(P0.01)。并且KAP1.1基因在絨毛生長(zhǎng)期表達(dá)量最高,而KAP11.1表達(dá)量最低。而在絨毛的休止期的K4P家族基因之間表達(dá)都有極顯著性差異(P0.01)。KAP13.1基因在絨毛的休止期表達(dá)量最高,而KAP3.1基因表達(dá)量最低。通過(guò)生長(zhǎng)期和休止期KAP家族基因表達(dá)差異的比較,本研究發(fā)現(xiàn)KAP3.1基因在生長(zhǎng)期的表達(dá)量明顯高于休止期,說(shuō)明KAP3.1基因在絨毛生長(zhǎng)中起到促進(jìn)作用。而其他三個(gè)基因則是休止期高于生長(zhǎng)期,說(shuō)明KAP1.1.KAPi1.1和KAPl3.1基因在絨毛生長(zhǎng)中起到抑制作用。而KAP13.1基因在休止期和生長(zhǎng)期的表達(dá)差異量要明顯高于其他兩個(gè)基因,因此KAPl3.1基因在抑制絨毛的生長(zhǎng)方面起到更重要的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S823.85

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1517774