本文關(guān)鍵詞： 產(chǎn)氣莢膜梭菌Beta2毒素 細(xì)胞毒性 單克隆抗體 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞因子　出處：《寧夏大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：產(chǎn)氣莢膜梭菌是引起人及家畜出血性、壞死性腸炎和腸毒血癥的主要病原菌,菌體產(chǎn)生的多種外毒素在產(chǎn)氣莢膜梭菌致病性中扮演了重要角色,產(chǎn)氣莢膜梭菌Beta2毒素(CPB2)即為其中一種主要的致死性毒素。目前,關(guān)于Beta2毒素細(xì)胞毒性和致病機(jī)理的研究,國內(nèi)外報(bào)道均很少,而只有深入地研究其生化特性、細(xì)胞毒性和致病機(jī)理才能更好地預(yù)防、檢測和治療該菌感染引起的疾病。本項(xiàng)目利用基因重組技術(shù)獲得純化的重組Beta2毒素蛋白(rCPB2),制備和篩選獲得針對該蛋白的單克隆抗體,并對Beta2重組毒素作用靶細(xì)胞的過程進(jìn)行示蹤研究;通過分析純化Beta2重組毒素作用靶細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡率、ROS和NO的積累量、線位體膜損傷情況,以及BCL-2蛋白家族及Caspase蛋白家族等細(xì)胞凋亡信號通路中蛋白分子的表達(dá)變化,探討了 Beta2毒素的細(xì)胞毒性,揭示其誘導(dǎo)宿主細(xì)胞損傷的可能分子機(jī)制。最后利用純化的CPB2重組毒素蛋白對小鼠以尾靜脈注射和灌胃兩種途徑分別作用于成年小鼠和乳鼠體內(nèi),檢測分析了小鼠血清、小腸組織和脾臟中的Th1/Th2/Th17細(xì)胞亞群分泌的炎性細(xì)胞因子的變化。綜合評價(jià)分析以上rCPB2的細(xì)胞毒性及可能誘發(fā)機(jī)體的炎性損傷機(jī)制,揭示了 Beta2毒素對宿主細(xì)胞的損傷機(jī)理,闡明產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引發(fā)動(dòng)物腸炎的可能致病機(jī)制,為進(jìn)一步開展產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病機(jī)理研究和制訂免疫預(yù)防策略提供理論依據(jù)。主要取得了以下研究結(jié)果:1、利用基因重組技術(shù)構(gòu)建并篩選獲得BL21(pTIG-cpb2)重組大腸桿菌,實(shí)現(xiàn)了 Beta2重組毒素的大量表達(dá),并利用AKTA純化系統(tǒng)的金屬離子親和層析法獲得純化的重組Beta2毒素(rCPB2);經(jīng)去除內(nèi)毒素后,以人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞(NCM460)為靶細(xì)胞,使用噻唑藍(lán)比色檢測技術(shù)對純化Beta2重組毒素的毒性進(jìn)行了初步檢測;結(jié)果表明,重組Beta2毒素具有與天然毒素相似的生物學(xué)毒性,其ID50為15μg/mL。2、通過雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)建立并篩選獲得三株針對產(chǎn)氣莢膜梭菌Beta2毒素的雜交瘤細(xì)胞系,McAb 1E23,2G7和2H7;經(jīng)檢測確定三種單克隆抗體(McAb)均能通過免疫印跡、ELISA、免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)和毒素中和實(shí)驗(yàn)識別重組的rCPB2。在所有測試中,McAb 1E23在這三種McAb中顯示出對rCPB2毒素蛋白和天然CPB2毒素蛋白最寬泛和最特異性的免疫學(xué)反應(yīng),而且其對rCPB2的免疫熒光分析染色還示蹤證實(shí)了 rCPB2首先通過與細(xì)胞膜結(jié)合,然后跨膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化過程;這些抗體將為研究CPB2的細(xì)胞毒性與致病機(jī)制、毒素的檢測提供可靠的工具,甚至可能在臨床治療時(shí)中和CPB2毒素發(fā)揮作用。3、純化的重組產(chǎn)氣莢膜梭菌Beta2毒素(rCPB2)刺激人正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞(NCM460)后誘導(dǎo)了 Caspase依賴性的細(xì)胞凋亡程序,這一過程具有毒素作用劑量和時(shí)間的依賴性,同時(shí)伴隨著細(xì)胞線粒體膜電位下降、促凋亡蛋白Bax、Puma的表達(dá)水平的上調(diào),抗凋亡蛋白Bcl-xl、Mcl-1和phospho-Bcl-2的表達(dá)水平的下調(diào)。4、通過尾靜脈注射和灌胃兩種途徑將純化的產(chǎn)氣莢膜梭菌Beta2毒素重組蛋白(rCPB)分別作用于成年小鼠和乳鼠后,利用蛋白芯片技術(shù)檢測小鼠血清、小腸和脾臟組織中Th1、Th2、Th17細(xì)胞亞群分泌的細(xì)胞因子變化的結(jié)果顯示,rCPB2處理的成年小鼠和乳鼠的血清、小腸和脾臟組織中 IL-1β、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、IL-10、IL-17、IL-23、GM-CSFandTNF-α 的含量均與未處理組有顯著性差異,提示rCPB2體內(nèi)毒性作用過程可能與誘發(fā)機(jī)體的炎癥反應(yīng)相關(guān)。綜合以上Beta2重組毒素作用于細(xì)胞模型和動(dòng)物模型所獲得的結(jié)果,我們推測產(chǎn)氣莢膜梭菌Beta2毒素刺激動(dòng)物腸黏膜上皮細(xì)胞的損傷機(jī)制可能是:Beta2毒素產(chǎn)生后,會(huì)在短時(shí)間內(nèi)結(jié)合到宿主細(xì)胞膜上,并迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿,刺激靶細(xì)胞TNF-α等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)并發(fā)生炎性反應(yīng),同時(shí)破壞了受刺激細(xì)胞的線粒體膜的完整性,并積累過量的ROS,啟動(dòng)了依賴Caspase的細(xì)胞凋亡途徑,造成受刺激細(xì)胞的凋亡,進(jìn)而造成動(dòng)物腸道的損傷,引發(fā)動(dòng)物腸炎的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：寧夏大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S859.8

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1515477