本文關(guān)鍵詞： mi R-660 ARHGEF12 骨骼肌 細(xì)胞增殖分化　出處：《江蘇師范大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：microRNA是當(dāng)今生命科學(xué)中研究最為普遍的一類非編碼RNA,現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)資料揭示,microRNA在動物骨骼肌發(fā)育階段扮演著重要的調(diào)控角色。在本研究中,借助實(shí)驗(yàn)室先前有關(guān)秦川牛骨骼肌microRNA高通量測序結(jié)果,初步篩選出時空差異表達(dá)的microRNA,采用RT-qPCR技術(shù)獲取秦川牛不同發(fā)育時期(胎牛期、犢牛期),不同組織(腿肌、心臟、肝臟、脾臟,肺、腎臟、胃、腸)的microRNA表達(dá)譜,并加以整理分析,最終選擇miR-660為實(shí)驗(yàn)對象,研究其對骨骼肌發(fā)育的影響。本研究通過miR-660 mimics或miR-660 inhibitor在小鼠成肌細(xì)胞系C2C12中過表達(dá)或干擾miR-660,并誘導(dǎo)C2C12增殖及分化,利用RT-qPCR,Westerrn Blot在mRNA及蛋白水平上測定相關(guān)增殖分化標(biāo)志基因的表達(dá),探究miR-660對骨骼肌增殖分化的影響。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)確認(rèn)了ARHGEF12是miR-660的靶基因,此后通過RT-qPCR,Westerrn Blot檢測,在mRNA及蛋白水平上進(jìn)一步證實(shí)miR-660與ARHGEF12間的靶向關(guān)系。此外,本實(shí)驗(yàn)還對靶基因ARHGEF12參與Rho A/Rho A kinase信號通路的可能性進(jìn)行了探討。本研究取得的主要結(jié)果如下:(1)相關(guān)序列保守性分析顯示成熟miR-660以及其靶基因ARHGEF12 3’UTR上的microRNA結(jié)合位點(diǎn)在人、牛等不同物種間具有高度保守性。(2)miR-660在秦川牛不同發(fā)育階段(胎牛期、犢牛期),不同組織(腿肌、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、胃、腸)內(nèi)普遍表達(dá),并且miR-660在胎牛及成年牛骨骼肌中的表達(dá)量呈現(xiàn)出顯著的差異(P0.01),表明miR-660屬于非特異性肌肉相關(guān)microRNA。(3)將miR-660 mimics,negative control(NC),miR-660 inhibitors或anti-negative control(anti-NC)轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞,過表達(dá)或抑制miR-660。利用RT-qPCR,Westerrn Blot技術(shù)驗(yàn)證過表達(dá)或抑制miR-660對C2C12細(xì)胞增殖分化的影響。結(jié)果表明miR-660促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖,抑制分化。(4)成功構(gòu)建了ARHGEF12、CDH13、ETV1、GNAS、HIF1A、SDC1、TPM4這7個靶基因及其突變體熒光素酶報告基因載體。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)確認(rèn)了ARHGEF12是miR-660的靶基因。RT-qPCR、Westerrn Blot檢測過表達(dá)或干擾miR-660對ARHGEF12表達(dá)量的影響,結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)ARHGEF12是miR-660的靶基因。(5)通過研究miR-660與Rho A/Rho A kinase信號通路的聯(lián)系,推測miR-660可能通過靶向ARHGEF12影響骨骼肌的分化。
[Abstract]:MicroRNA is one of the most common noncoding RNAs in the life sciences. The current literature shows that microRNAs play an important role in the development of animal skeletal muscle. Based on the results of high throughput sequencing of microRNA in the skeletal muscle of Qinchuan cattle, the spatio-temporal differentially expressed microRNAs were preliminarily screened. The RT-qPCR technique was used to obtain different tissues (leg muscle, heart, liver) of Qinchuan cattle at different developmental stages (fetal cattle stage, calf stage, calf stage), and different tissues (leg muscle, heart, liver). MicroRNA expression profiles of spleen, lung, kidney, stomach and intestine were analyzed, and miR-660 was selected as experimental object. In this study, miR-660 mimics or miR-660 inhibitor were used to overexpression or interfere with miR-660 in mouse myoblast cell line C2C12, and to induce proliferation and differentiation of C2C12. In order to explore the effect of miR-660 on skeletal muscle proliferation and differentiation, RT-qPCR Westerrn Blot was used to detect the expression of related proliferative and differentiation marker genes at the mRNA and protein levels. The double luciferase reporter gene system confirmed that ARHGEF12 was the target gene of miR-660, and then detected by RT-qPCRG Westerrn Blot. The targeting relationship between miR-660 and ARHGEF12 was further confirmed at the level of mRNA and protein. The possibility of the target gene ARHGEF12 participating in the Rho A / Rho A kinase signaling pathway was also investigated. The main results obtained in this study are as follows: 1) the analysis of the conserved sequence shows that the mature miR-660 and the microRNA binding site on its target gene ARHGEF12 3 UTR are human. Among different species such as cattle, there is a high degree of conserved expression in Qinchuan cattle at different developmental stages (fetal cattle, calves, leg muscle, heart, liver, spleen, lung, kidney, stomach, intestine), and in different tissues (leg muscle, heart, liver, spleen, lung, kidney, stomach, intestine). There was a significant difference in the expression of miR-660 between fetal and adult bovine skeletal muscle, indicating that miR-660 belongs to non-specific muscle-related microRNA.3. miR-660 mimicsnegative control inhibitors was transfected into C2C12 cells by transfection of miR-660 mimicsnegative control inhibitors or anti-negative control-anti-NC12 cells. Overexpression or inhibition of miR-660. the effects of overexpression or inhibition of miR-660 on the proliferation and differentiation of C2C12 cells were examined by RT-qPCR- Westerrn Blot technique. The results showed that miR-660 promoted the proliferation of myoblasts. The seven target genes and their mutant luciferase reporter gene vectors, ARHGEF12, CDH13, ETV1, GNASHIF1, TPM4, and its mutant luciferase reporter gene, were successfully constructed. The double luciferase reporter gene system confirmed that ARHGEF12 is the target gene of miR-660. RT-qPCRWesterrn Blot was used to detect the effect of overexpression or interference miR-660 on the expression of ARHGEF12. Results further confirmed that ARHGEF12 is the target gene of miR-660. By studying the relationship between miR-660 and Rho A / Rho A kinase signaling pathway, we speculated that miR-660 might affect skeletal muscle differentiation by targeting ARHGEF12.
【學(xué)位授予單位】：江蘇師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S823;Q78

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本文編號：1505751