本文關(guān)鍵詞： O型口蹄疫病毒 VP1蛋白 原核表達(dá) 間接ELISA 單克隆抗體　出處：《河南科技大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一種烈性動(dòng)物傳染病,嚴(yán)重危害畜牧業(yè)健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全,我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。目前控制該病的主要方法是抗體檢測(cè)和疫苗免疫相結(jié)合。FMDV有7個(gè)血清型,不同血清型的FMDV之間無交叉保護(hù)性,引起我國(guó)牲畜發(fā)病的血清型主要有O、A、AsiaⅠ三個(gè)血清型,其中O型流行最為廣泛。VP1蛋白作為O型FMDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,包含其中大部分刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的中和性抗原位點(diǎn),分別位于羧基端200-213位氨基酸殘基的線性表位上、B-C環(huán)上和G-H環(huán)內(nèi),因此VP1抗體作為FMDV免疫產(chǎn)生的主要中和抗體,是評(píng)估疫苗免疫效果的重要依據(jù)。本試驗(yàn)將轉(zhuǎn)化了VP1融合蛋白基因的JM109在IPTG的誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)并進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化;以VP1融合蛋白(rVP1蛋白)為包被抗原建立了間接ELISA抗體檢測(cè)方法,以PEG 2000為融合劑將免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合,有限稀釋法篩選陽(yáng)性克隆,制備單克隆抗體并進(jìn)行鑒定。試驗(yàn)結(jié)果如下:1、O型FMDV VP1基因的克隆與原核表達(dá)參考GeneBank上發(fā)表的O型FMDV VP1基因序列,設(shè)計(jì)兩條特異性引物,通過PCR擴(kuò)增,將其克隆至表達(dá)載體pQE-30上,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE鑒定,結(jié)果顯示:VP1基因擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小約為560 bp,與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致;表達(dá)的O型rVP1蛋白大小約為26 kDa,純化效果較好,未見其他雜帶,蛋白濃度達(dá)2.85 mg/mL,說明O型rVP1蛋白得到了高效地表達(dá);Western-blot鑒定結(jié)果說明表達(dá)的O型rVP1蛋白具有很好的反應(yīng)原性。O型rVP1蛋白的成功表達(dá)為建立O型FMDV VP1抗體血清學(xué)檢測(cè)方法打下了基礎(chǔ)。2、間接ELISA檢測(cè)抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗體方法的建立采用方陣滴定法對(duì)抗原包被濃度、包被條件、血清稀釋濃度、酶標(biāo)二抗稀釋濃度、最適封閉劑進(jìn)行篩選,進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示:最佳包被抗原濃度為2.0μg/mL,最佳包被溫度和時(shí)間為4℃過夜,血清最適稀釋倍數(shù)為l∶200,酶標(biāo)二抗最適稀釋倍數(shù)為l∶3000,最適封閉液為1%BSA-PBST溶液。該方法與A型FMDV、AsiaⅠ型FMDV、SVDV陽(yáng)性血清不發(fā)生反應(yīng),僅與O型FMDV陽(yáng)性血清反應(yīng),表明其特異性良好。本研究建立的間接ELISA為我國(guó)O型FMDV VP1抗體檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)便快捷的檢測(cè)方法。3、抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白單克隆抗體的鑒定及鑒定本研究以高濃縮的O型FMDV滅活疫苗免疫BALB/c小鼠,取陽(yáng)性免疫鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合,采用間接ELISA方法鑒定,經(jīng)4次亞克隆后,篩選能穩(wěn)定分泌抗O型FMDV VP1蛋白MAbs的雜交瘤細(xì)胞株。將雜交瘤細(xì)胞株注入小鼠腹腔制備腹水,選取腹水效價(jià)高的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行單抗亞型鑒定及純化;測(cè)定雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目、相對(duì)親和力常數(shù)、特異性、穩(wěn)定性等生物學(xué)特性;采用阻斷ELISA試驗(yàn)檢測(cè)單抗與O型FMDV反應(yīng)的特異性。結(jié)果:篩選出了1株可穩(wěn)定分泌抗O型FMDV VP1蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株(1C7),1C7的染色體數(shù)高于任一親本細(xì)胞的染色體數(shù)目;腹水的抗體效價(jià)為1:105,濃度為4.7 mg/m L。1C7分泌的MAbs亞型鑒定為Ig G2b;相對(duì)親和力常數(shù)為1.5 mol/L;間接ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明其可以特異性地與O型FMDV反應(yīng),而與A型、AsiaⅠ型FMDV及豬水泡病病毒均不發(fā)生交叉反應(yīng);Westernblot試驗(yàn)結(jié)果表明MAbs可特異性與原核表達(dá)的O型重組VP1蛋白(O-rVP1)反應(yīng);雜交瘤細(xì)胞傳代至30代、在液氮中凍存12月后復(fù)蘇,其分泌抗體穩(wěn)定;阻斷ELISA試驗(yàn)表明1C7單抗能夠被O型FMDV免疫血清特異性地阻斷。本研究為進(jìn)一步建立基于單抗檢測(cè)O型FMDV抗體和病原的阻斷ELISA及膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：河南科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1503933