本文關鍵詞： O型口蹄疫病毒 VP1蛋白 原核表達 間接ELISA 單克隆抗體　出處：《河南科技大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一種烈性動物傳染病,嚴重危害畜牧業(yè)健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全,我國將其列為一類動物疫病。目前控制該病的主要方法是抗體檢測和疫苗免疫相結合。FMDV有7個血清型,不同血清型的FMDV之間無交叉保護性,引起我國牲畜發(fā)病的血清型主要有O、A、AsiaⅠ三個血清型,其中O型流行最為廣泛。VP1蛋白作為O型FMDV的主要結構蛋白,包含其中大部分刺激機體產生中和抗體的中和性抗原位點,分別位于羧基端200-213位氨基酸殘基的線性表位上、B-C環(huán)上和G-H環(huán)內,因此VP1抗體作為FMDV免疫產生的主要中和抗體,是評估疫苗免疫效果的重要依據(jù)。本試驗將轉化了VP1融合蛋白基因的JM109在IPTG的誘導下進行表達并進行表達條件的優(yōu)化;以VP1融合蛋白(rVP1蛋白)為包被抗原建立了間接ELISA抗體檢測方法,以PEG 2000為融合劑將免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合,有限稀釋法篩選陽性克隆,制備單克隆抗體并進行鑒定。試驗結果如下:1、O型FMDV VP1基因的克隆與原核表達參考GeneBank上發(fā)表的O型FMDV VP1基因序列,設計兩條特異性引物,通過PCR擴增,將其克隆至表達載體pQE-30上,轉化至大腸桿菌JM109中,經(jīng)IPTG誘導表達后進行SDS-PAGE鑒定,結果顯示:VP1基因擴增產物條帶大小約為560 bp,與預期擴增片段大小一致;表達的O型rVP1蛋白大小約為26 kDa,純化效果較好,未見其他雜帶,蛋白濃度達2.85 mg/mL,說明O型rVP1蛋白得到了高效地表達;Western-blot鑒定結果說明表達的O型rVP1蛋白具有很好的反應原性。O型rVP1蛋白的成功表達為建立O型FMDV VP1抗體血清學檢測方法打下了基礎。2、間接ELISA檢測抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗體方法的建立采用方陣滴定法對抗原包被濃度、包被條件、血清稀釋濃度、酶標二抗稀釋濃度、最適封閉劑進行篩選,進行特異性實驗。結果顯示:最佳包被抗原濃度為2.0μg/mL,最佳包被溫度和時間為4℃過夜,血清最適稀釋倍數(shù)為l∶200,酶標二抗最適稀釋倍數(shù)為l∶3000,最適封閉液為1%BSA-PBST溶液。該方法與A型FMDV、AsiaⅠ型FMDV、SVDV陽性血清不發(fā)生反應,僅與O型FMDV陽性血清反應,表明其特異性良好。本研究建立的間接ELISA為我國O型FMDV VP1抗體檢測提供了一種簡便快捷的檢測方法。3、抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白單克隆抗體的鑒定及鑒定本研究以高濃縮的O型FMDV滅活疫苗免疫BALB/c小鼠,取陽性免疫鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合,采用間接ELISA方法鑒定,經(jīng)4次亞克隆后,篩選能穩(wěn)定分泌抗O型FMDV VP1蛋白MAbs的雜交瘤細胞株。將雜交瘤細胞株注入小鼠腹腔制備腹水,選取腹水效價高的雜交瘤細胞株進行單抗亞型鑒定及純化;測定雜交瘤細胞的染色體數(shù)目、相對親和力常數(shù)、特異性、穩(wěn)定性等生物學特性;采用阻斷ELISA試驗檢測單抗與O型FMDV反應的特異性。結果:篩選出了1株可穩(wěn)定分泌抗O型FMDV VP1蛋白抗體的雜交瘤細胞株(1C7),1C7的染色體數(shù)高于任一親本細胞的染色體數(shù)目;腹水的抗體效價為1:105,濃度為4.7 mg/m L。1C7分泌的MAbs亞型鑒定為Ig G2b;相對親和力常數(shù)為1.5 mol/L;間接ELISA試驗結果表明其可以特異性地與O型FMDV反應,而與A型、AsiaⅠ型FMDV及豬水泡病病毒均不發(fā)生交叉反應;Westernblot試驗結果表明MAbs可特異性與原核表達的O型重組VP1蛋白(O-rVP1)反應;雜交瘤細胞傳代至30代、在液氮中凍存12月后復蘇,其分泌抗體穩(wěn)定;阻斷ELISA試驗表明1C7單抗能夠被O型FMDV免疫血清特異性地阻斷。本研究為進一步建立基于單抗檢測O型FMDV抗體和病原的阻斷ELISA及膠體金免疫層析快速檢測方法奠定了基礎。
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【學位授予單位】：河南科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

【參考文獻】

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本文編號：1503933