本文關(guān)鍵詞： miRNA AANAT 表達(dá)量 松果體 靶關(guān)系 雙熒光素酶報告基因檢測　出處：《揚州大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：miRNAs是一類長度為21-24nt的非編碼小RNA,通過與靶mRNAs的3'-UTR結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平上沉默基因表達(dá),參與多種生理、生化、病理過程。松果體是動物季節(jié)性發(fā)情主要生理途徑的重要組成部分,通過分泌褪黑激素,調(diào)節(jié)下丘腦促性腺激素釋放激素的脈沖式釋放,進(jìn)一步通過下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控季節(jié)性繁殖活動。芳基烷基胺-氮-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(AANAT)是合成褪黑激素的關(guān)鍵酶,參與調(diào)控動物季節(jié)性繁殖。本研究旨在探究miRNA在綿羊不同發(fā)情狀態(tài)松果體組織中的表達(dá)差異及其對AANAT的表觀遺傳調(diào)控作用。根據(jù)前期獲得的綿羊轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,驗證綿羊松果體中部分miRNAs及AANAT在不同時期的表達(dá)差異,運用生物信息學(xué)方法預(yù)測候選miRNAs和AANAT的靶關(guān)系,最后利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)對其進(jìn)行驗證。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：1、基于前期通過轉(zhuǎn)錄組分析確定的綿羊不同發(fā)情狀態(tài)松果體組織差異表達(dá)的AANAT基因和5個候選miRNA(miR-118,-247,-364,-406,-892),進(jìn)行熒光定量分析,結(jié)果表明綿羊AANAT基因的表達(dá)乏情期高于發(fā)情間期,發(fā)情間期和發(fā)情前期保持上調(diào)趨勢至發(fā)情期達(dá)到峰值,miR-364、miR-892、miR-406在四個時期間的表達(dá)趨勢與AANAT基因相反,miR-118、miR-247的表達(dá)量在乏情期至發(fā)情間期升高,發(fā)情間期至發(fā)情前期降低,發(fā)情前期至發(fā)情期升高。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)AANAT與miR-364、miR-406呈顯著負(fù)相關(guān)(R2=0.572；P0.05),與miR-892呈顯著負(fù)相關(guān)(R2=0.669；P0.05)。2、利用3'RACE法擴(kuò)增出AANAT的3'-UTR并進(jìn)行測序,然后運用miRanda和RNAhybrid等生物信息學(xué)軟件預(yù)測靶AANAT 3'-UTR區(qū)的miRNAs,確定miR-118、miR-247與AANAT存在靶結(jié)合位置。3、miR-118、miR-247與AANAT的靶關(guān)系驗證。將合成的AANAT 3'-UTR野生型(WT)和突變型(MUT)序列構(gòu)建到pmirGLO載體中,將miR-118、miR-247的成熟序列和miRNA陰性對照(NE)構(gòu)建到pcDNA6.2TM-GW/EmGFP-miR載體中。實驗分別分為4個實驗組(WT+miRNA組,MUT+miRNA組,WT+NE組,MUT+NE組)和1個空白對照組,每個組設(shè)3個重復(fù),然后轉(zhuǎn)染到293FT細(xì)胞中,雙熒光素酶報告檢測表明miR-118對野生型AANAT 3'-UTR重組質(zhì)粒表達(dá)的熒光素酶活性有顯著地抑制效果(P0.01),說明miR-118可以與AANAT的3'-UTR區(qū)序列相互作用并且明確了具體作用的靶位點,證實miR-118和AANAT存在靶關(guān)系。然而,miR-247對野生型AANAT 3'-UTR重組質(zhì)粒表達(dá)的熒光素酶活性沒有顯著地抑制效果,表明miR-247與AANAT基因不存在靶關(guān)系。
[Abstract]:MiRNAs is a kind of non-coding small RNAs 21-24nt in length. It is involved in many physiological, biochemical and pathological processes by silencing gene expression at the post-transcriptional level by binding to the target mRNAs 3H-UTR. Pineal gland is an important part of the main physiological pathway of seasonal estrus in animals. By secreting melatonin, regulating the pulse release of hypothalamic gonadotropin releasing hormone, Further regulation of seasonal reproductive activity through hypothalamus-pituitary-gonad axis. Aryl alkylamine-azo-acetyltransferase gene (AANATA) is the key enzyme for melatonin synthesis. The aim of this study was to investigate the difference of miRNA expression in the pineal tissues of sheep in different estrous states and its effect on the epigenetic regulation of AANAT. The expression differences of miRNAs and AANAT in the pineal gland of sheep at different stages were verified. The target relationship between candidate miRNAs and AANAT was predicted by bioinformatics. At last, the double luciferase reporter gene detection system was used to verify it. The main contents and results were as follows: 1, based on the differentially expressed AANAT base of pineal tissues in different estrous states of sheep identified by transcriptome analysis. Fluorescence quantitative analysis was carried out for miR-118N -247C ~ (-364N) -406N ~ (-892N), and 5 candidate miRNAs (miRNAs) and 5 candidate miRNAs (miRNAs). The results showed that the expression of AANAT gene in sheep was higher in estrus than in estrus. During estrus and early estrus, the expression trend of miR-364miR-892miR-406 increased from estrus to estrus, and decreased from estrus to preestrus, contrary to that of AANAT gene, and the expression of miR-247 increased during estrus to estrus, and decreased from estrus to preestrus. From early estrus to estrus, it was found that there was a significant negative correlation between AANAT and miR-364miR-406 and miR-892, and a significant negative correlation between AANAT and miR-892. The AANAT 3G -UTR was amplified by 3G race method and sequenced. Then using bioinformatics software, such as miRanda and RNAhybrid, to predict the miRNAss in the target AANAT 3O -UTR region, and to determine the target binding position between miR-118 miR-247 and AANAT. The target relationship between miR-247 and AANAT was verified. The synthesized AANAT 3H-UTR wild type WTand mutants were constructed into pmirGLO vector. The mature sequence of miR-118mmiR-247 and miRNA negative control neon) were constructed into pcDNA6.2TM-GW/EmGFP-miR vector. The experiment was divided into four experimental groups: WT miRNA group, mut miRNA group (WT NE group) and a blank control group. Each group was transfected into 293FT cells with 3 repeats. The detection of double luciferase report showed that miR-118 could inhibit the luciferase activity of wild-type AANAT _ 3 ~ (-UTR) recombinant plasmid significantly, indicating that miR-118 could interact with the 3 ~ (-) -UTR region of AANAT and identify the specific target sites. It was confirmed that there was a target relationship between miR-118 and AANAT, however, the activity of luciferase expressed in wild type AANAT 3N-UTR recombinant plasmid was not significantly inhibited by mmiR-247, indicating that there was no target relationship between miR-247 and AANAT gene.
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S826

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本文編號：1498649