本文關(guān)鍵詞： ISG43 ISG60 蛋白表達(dá) 多克隆抗體　出處：《廣西大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：ISG60屬于IFIT家族成員,是一類干擾素誘導(dǎo)基因,在進(jìn)化上高度保守。在干擾素、病毒、脂多糖等條件的刺激下,ISG60基因高效表達(dá),主要作用于翻譯的起始、病毒的復(fù)制、I型干擾素的反饋調(diào)節(jié)、細(xì)胞的遷移和增殖等。ISG43于1999年首次被Liu等發(fā)現(xiàn)并報(bào)道其去泛素化功能,又稱為UBP43,是泛素特異性蛋白酶(UBP)家族成員。2002年,Malakhov等首次發(fā)現(xiàn)UBP43的去ISG化ISGylation功能,部分缺失UBP43基因的細(xì)胞會(huì)發(fā)生干擾素過敏導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,由此可見ISG43是維持ISG化動(dòng)態(tài)平衡的關(guān)鍵。本研究克隆了 ISG60和ISG43基因,將這些基因連接到pMD18-T載體,測(cè)序正確后再用Xho I和BamH I雙酶切法插入PET-32a(+)克隆位點(diǎn),成功構(gòu)建了 PET-ISG60和PET-ISG43重組原核表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)衍生菌并用不同濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),經(jīng)SDS-PAGE 和 Western-Blot 分析顯示,ISG43 在 0.5 mM IPTG 誘導(dǎo)下表達(dá)最好,ISG60在0.05mMIPTG誘導(dǎo)下表達(dá)最好,ISG43和ISG60兩者的重組蛋白都能以包涵體和可溶性蛋白兩種形式進(jìn)行表達(dá)。通過可溶性蛋白形式純化蛋白獲得有活性的免疫原,以純化的ISG43和ISG60重組活性蛋白作為抗原與弗式佐劑一起免疫小鼠。經(jīng)過四次免疫后獲得了反應(yīng)性和特異性較高的多克隆抗體。用Western Blot檢測(cè),產(chǎn)生的抗體能與原核表達(dá)蛋白發(fā)生反應(yīng),又能與PK-15細(xì)胞中經(jīng)PolyI:C誘導(dǎo)產(chǎn)生的相應(yīng)蛋白顯示良好反應(yīng)性。抗體在稀釋比例為1:2000、1:4000、1:8000情況下都能與原核表達(dá)蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。同樣,抗體在稀釋比例為1:600和1:1200時(shí)也能與PK-15細(xì)胞中表達(dá)的相應(yīng)蛋白發(fā)生反應(yīng)。
[Abstract]:ISG60, a member of the IFIT family, is a family of interferon-inducible genes, which is highly conserved in evolution. It is highly expressed under the stimulation of interferon, virus, lipopolysaccharide and plays an important role in the initiation of translation. The feedback regulation of interferon type I, cell migration and cell proliferation of virus replication. ISG43 was first discovered by Liu et al in 1999 and its deubiquitin function was reported. Also known as UBP43, UBP43 is a member of the UBP family of ubiquitin specific protease. In 2002, Malakhov et al first discovered the function of ISG free ISGylation in UBP43. Some cells with UBP43 gene deletion may develop interferon allergy and lead to apoptosis. In this study, ISG60 and ISG43 genes were cloned, ligated to pMD18-T vector, sequenced correctly, then inserted into PET-32a () cloning site by Xho I and BamH I double enzyme digestion. The recombinant prokaryotic expression plasmids of PET-ISG60 and PET-ISG43 were successfully constructed. The recombinant plasmids were transformed into Rosetta-DE3) derived bacteria and induced by different concentrations of IPTG. SDS-PAGE and Western-Blot analysis showed that ISG43 expressed best when induced by 0.5 mMIPTG. The recombinant protein of ISG43 and ISG60 could be expressed as inclusion body and soluble protein under the induction of 0.05 mMIPTG. The recombinant protein could be expressed in two forms: inclusion body and soluble protein. Form purified protein to obtain active immunogen, The purified ISG43 and ISG60 recombinant active proteins were used as antigens to immunize mice with Freund adjuvant. After four times of immunization, reactive and specific polyclonal antibodies were obtained. Western Blot was used to detect these antibodies. The antibody can react with prokaryotic expression protein and the corresponding protein induced by PolyI:C in PK-15 cells. The antibody can react specifically with prokaryotic expression protein when the dilution ratio is 1: 2000 / 1: 4 000 or 1: 8 000. At dilution ratios of 1: 600 and 1: 1200, antibodies also reacted with the corresponding proteins expressed in PK-15 cells.
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.4;Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1497439