本文關(guān)鍵詞： 附睪 活性氧 GPx5 細胞培養(yǎng) 附睪上皮細胞 雄激素 氫化可的松 細胞增殖 雄激素受體　出處：《內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：附睪是精子成熟的主要場所,對其功能功能調(diào)節(jié)機理的詳細研究,在提高雄性繁殖能力等方面有重要的理論指導意義。谷胱甘肽過氧化物酶5(Glutathione Peroxidase 5,GPx5)作為具有抗氧化作用的附睪特異表達蛋白,在精子抗氧化保護及附睪微環(huán)境穩(wěn)定維持中發(fā)揮著重要作用。國內(nèi)外尚沒有GPx5在山羊附睪的詳細研究,本研究以內(nèi)蒙古絨山羊為研究對象,檢測了初情期、體成熟期和老齡期3個生殖生理階段睪丸和附睪不同部位GPx5的表達規(guī)律,首次建立了純度高、穩(wěn)定性好的絨山羊附睪上皮細胞培養(yǎng)體系,并探討了甾體類激素對絨山羊附睪上皮細胞增殖的影響及GPx5表達調(diào)節(jié)的可能機制。研究結(jié)果如下:1.采用熒光定量PCR、免疫印跡和免疫組化法檢測了初情期、體成熟期和老齡期絨山羊睪丸和附睪各部GPx5 mRNA和蛋白表達量。結(jié)果顯示各生殖生理階段絨山羊睪丸中均未見GPx5表達,附睪中均有GPx5表達。各生殖生理階段附睪表達區(qū)域及表達量存在差異:初情期,GPx5 mRNA和蛋白主要表達于附睪頭部;體成熟期,附睪各區(qū)域GPx5 mRNA和蛋白的表達量極顯著高于其他階段,附睪起始部和附睪頭部為主要表達區(qū);老齡期,GPx5 mRNA和蛋白主要表達于附睪頭部,但較體成熟期明顯減少。免疫組化定位顯示GPx5蛋白主要分布于附睪上皮細胞,而且各年齡階段絨山羊附睪腔內(nèi)精子上都有明顯的GPx5陽性信號。研究表明絨山羊附睪GPx5的表達區(qū)域及表達量變化與動物生殖生理階段直接相關(guān)。2.10-12月齡絨山羊附睪起始部及頭部分別采用酶消化法和改良組織塊消化法進行原代培養(yǎng),利用免疫細胞化學染色法和免疫熒光化學法對細胞進行鑒定,同時利用流式細胞儀和Cell Counting Kit(CCK)法分別檢測了細胞純度和增殖情況,并在電鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明,兩種培養(yǎng)方法所獲細胞均呈島嶼狀克隆生長,均有較好的增殖能力,并具有活躍的分泌和代謝功能;上皮細胞特異性角蛋白18(Cytokeratin 18,CK18)和GPx5的表達以及流式細胞儀結(jié)果顯示,兩種方法所獲細胞均為純度較高的附睪上皮細胞,但改良組織塊消化法獲得原代細胞需要的時間長,相比而言,酶消化法獲得原代細胞時間短,獲得的細胞量大。這為進一步研究絨山羊上皮提供了良好基礎。3.采用CCK法檢測睪酮、氫化可的松對細胞增殖的影響,細胞免疫化學法對體外培養(yǎng)附睪上皮細胞雄激素受體(Androgen Receptor,AR)定位,熒光定量PCR、ELISA法檢測AR mRNA和蛋白表達量。結(jié)果顯示,與對照組相比,低濃度睪酮(以100nmol.L-1為主)對附睪上皮細胞增殖有明顯促進作用,而高濃度睪酮(1000 nmol.L-1)對細胞增殖無顯著促進效應,表明睪酮對附睪上皮細胞增殖有促進作用,且具有劑量依賴性。200 nmol.L-1 氫化可的松對附睪上皮細胞也有促增殖作用。當200 nmol.L-1氫化可的松與100 nmol.L-1睪酮同時存在時對細胞增殖表現(xiàn)有協(xié)同作用。100 nmol.L-1睪酮與200 nmol.L-1氫化可的松均可上調(diào)附睪上皮細胞AR mRNA和蛋白表達量,二者共存時AR mRNA和蛋白表達量極顯著提高。另外,AR免疫細胞化學定位結(jié)果顯示,附睪上皮細胞有AR蛋白表達,且表達模式與組織內(nèi)表達相似。4.利用流式細胞技術(shù)檢測了外源性睪酮對附睪上皮細胞內(nèi)ROS(Reactive Oxygen Species)的影響,熒光定量PCR和ELISA法分別檢測了外源性睪酮對附睪上皮細胞內(nèi)GPx6和ARmRNA和蛋白表達量的影響。結(jié)果表明,低濃度睪酮能夠降低細胞內(nèi)ROS水平,高濃度睪酮(1000 nmol.L-1)則無此效應;100 nmol.L-1睪酮使GPx5表達量顯著提高,該效應可以被AR受體阻斷劑阻斷,高濃度睪酮對GPx5表達量較對照組無顯著性差異;100 nmol.L-1睪酮使AR表達量顯著上調(diào),高濃度睪酮使AR表達量較對照組顯著下調(diào)。表明,外源性低濃度睪酮可以上調(diào)AR數(shù)量進而提高附睪上皮細胞GPx5的表達量,能夠降低細胞內(nèi)ROS水平而對附睪上皮細胞起保護作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S827

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