發(fā)布時間：2018-01-26 19:38

  本文關(guān)鍵詞： 豬流行性腹瀉病毒(PEDV) S蛋白 Ⅱ型絲氨酸蛋白酶(TTSP) 病毒復(fù)制　出處：《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的,以各年齡豬嘔吐、腹瀉、脫水為特征的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。PED的暴發(fā)及流行給我國和世界養(yǎng)豬國家造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,現(xiàn)已成為仔豬早期死亡的重要疫病之一。近年來,有報道稱即使疫苗免疫過的豬群仍可感染PEDV,疫苗免疫效果的下降可能是由于PEDV流行毒株的變異導(dǎo)致的。因此探索PEDV感染的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,建立有效的分離培養(yǎng)方法,研發(fā)特效的新型藥物和高效的疫苗制品是各國學(xué)者關(guān)注并亟待解決的問題。而在實踐中,PEDV新流行毒株的分離培養(yǎng)難度大,細(xì)胞繁殖滴度低是制約對該病毒深入研究的重要障礙。近年來,有報道發(fā)現(xiàn)一些宿主蛋白酶,其中包括Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶(type Ⅱ transmembrane serine protease,TTSP)家族中的幾個成員,具有類似胰酶的催化活性,可以裂解活化流感病毒及一些冠狀病毒囊膜蛋白,在沒有胰酶的條件下促進(jìn)病毒侵入宿主細(xì)胞進(jìn)行繁殖復(fù)制,但是對于同是需要胰酶培養(yǎng)的PEDV繁殖影響的研究卻并不深入。本研究選取TTSP家族中跨膜絲氨酸蛋白酶2(transmembrane protease serine 2,TMPRSS2)、呼吸道胰酶樣蛋白酶(human airway trypsin-like protease,HAT)、鱗癌細(xì)胞差異表達(dá)蛋白酶1(differentially expressed squamous cell carcinoma gene 1,DESC1)和鑲嵌式長型絲氨酸蛋白酶(mosaic serine protease large-form,MSPL)進(jìn)行研究,分析其對PEDV繁殖的影響,并進(jìn)一步深入機(jī)理探究其對S蛋白的作用。由于PEDV體外連續(xù)傳代可能會失去對胰酶的依賴性,因此本研究首先確認(rèn)實驗室保存的PEDV分離株LJB/03低代次(P23)和高代次(P146)細(xì)胞培養(yǎng)毒對胰酶的依賴性。通過接毒病變情況,結(jié)合熒光定量PCR及S蛋白序列比對分析,結(jié)果表明LJB/03 P23具有胰酶依賴性,而LJB/03 P146在添加胰酶和不添加胰酶的條件下繁毒效果差異不大,具有胰酶不完全依賴性。通過PEDV S蛋白氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn),LJB/03 P146部分突變和缺失的氨基酸殘基與其他弱毒株突變位點一致,說明LJB/03 P146經(jīng)過連續(xù)傳代可能有弱化的趨勢。為了探究TTSPs對PEDV繁殖的影響,分別選取PEDV LJB/03 P23和P146作為研究對象,分析TMPRSS2、HAT、DESC1和MSPL對依賴胰酶和不完全依賴胰酶的PEDV毒株在Vero細(xì)胞上復(fù)制的作用。結(jié)果表明,TMPRSS2和MSPL有效促進(jìn)具有胰酶依賴性的PEDV LJB/03 P23毒株在不添加胰酶的Vero細(xì)胞上的繁殖,并提高病毒滴度,其中MSPL促進(jìn)效果最為顯著,甚至優(yōu)于3μg/mL胰酶的作用,HAT和DESC1則沒有顯著的促進(jìn)效果。而不完全依賴胰酶的LJB/03 P146對TTSPs和胰酶均不敏感。為評價TTSPs是否有助于PEDV流行毒株的體外分離培養(yǎng),將感染PEDV的仔豬小腸組織進(jìn)行處理,分別接種于瞬時表達(dá)TMPRSS2、HAT、DESC1和MSPL的Vero細(xì)胞,并與胰酶組進(jìn)行對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEDV分離毒株在表達(dá)TMPRSS2和MSPL的Vero細(xì)胞上可以穩(wěn)定傳代,并且繁殖效果要優(yōu)于HAT、DESC1和添加胰酶組。通過TTSPs對PEDV在Vero細(xì)胞上繁殖促進(jìn)作用的初步探索,結(jié)果顯示PEDV在Vero細(xì)胞上繁殖對TMPRSS2和MSPL具有計量依賴性,而HAT和DESC1對PEDV無激活活性。利用哺乳動物雙雜交系統(tǒng)結(jié)合雙熒光素酶檢測發(fā)現(xiàn),TMPRSS2和MSPL有效促進(jìn)感染LJB/03 P23的Vero細(xì)胞膜融合,其中MSPL優(yōu)于1μg/m L胰酶作用效果;而TTSPs對LJB/03 P146的促細(xì)胞膜融合效果并不顯著。為了研究TTSPs是否有助于PEDV病毒粒子侵入,并從反面驗證TTSPs對PEDV的復(fù)制有促進(jìn)作用,采用TTSP的抑制劑AEBSF-HCl與依賴胰酶特性的LJB/03 P23進(jìn)行研究。結(jié)果顯示,AEBSF-HCl具有顯著抑制TTSPs活性,從而使PEDV在表達(dá)TTSPs的Vero細(xì)胞上的繁殖抑制效果呈劑量依賴性,病毒mRNA水平隨抑制劑濃度增高而降低。為進(jìn)一步驗證TTSPs與PEDV LJB/03 P23、P146的相互作用,利用激光共聚焦試驗分析二者在細(xì)胞的定位情況。結(jié)果顯示,LJB/03 P23、P146與TMPRSS2和MSPL產(chǎn)生良好的共定位效果,而與HAT和DESC1并未觀察到共定位現(xiàn)象。為了深入探究TMPRSS2和MSPL促進(jìn)PEDV在宿主細(xì)胞中復(fù)制的機(jī)理,分別構(gòu)建了PEDV LJB/03親本株和P146毒株的S蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒,研究TTSPs對PEDV依賴胰酶的親本株和不完全依賴胰酶的適應(yīng)細(xì)胞株S蛋白的作用。胰酶對S蛋白裂解性試驗結(jié)果顯示,與18μg/m L胰酶作用后的S蛋白于150 k Da左右均有一條特異性的裂解條帶,且S蛋白的全長條帶亮度明顯減弱。該結(jié)果證實胰酶識別S蛋白的裂解位點在S2區(qū)的890位氨基酸,其裂解活性可以促進(jìn)病毒與宿主細(xì)胞膜融合,利于病毒粒子的侵入。為了研究TTSPs對PEDV S蛋白的裂解作用,分別將TTSPs與S蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染,結(jié)果顯示TMPRSS2和MSPL均可以將PEDV親本株和適應(yīng)細(xì)胞株的S蛋白裂解,產(chǎn)生約35 k Da的裂解條帶,而HAT和DESC1并未檢測到對S蛋白的裂解。分析TMPRSS2和MSPL可能識別裂解S1區(qū)域,該區(qū)域氨基酸具有PEDV受體結(jié)合區(qū)及識別輔助糖受體的功能。與胰酶的裂解作用不同的是,TMPRSS2和MSPL對S蛋白的裂解可能暴露PEDV纖突蛋白與宿主細(xì)胞受體結(jié)合區(qū),使病毒粒子更易于與細(xì)胞受體結(jié)合,促進(jìn)病毒侵入從而增強(qiáng)PEDV感染細(xì)胞的能力。通過激光共聚焦技術(shù)證實了TMPRSS2和MSPL可以與S蛋白之間發(fā)生相互作用。利用PEDV S蛋白包裝的假病毒模擬病毒粒子,進(jìn)一步驗證TTSPs在病毒侵入階段是否有促進(jìn)作用。結(jié)果顯示TMPRSS2和MSPL有效促進(jìn)PEDV親本株S蛋白包裝的假病毒侵入細(xì)胞,而這種激活作用很可能與絲氨酸蛋白酶對S蛋白的裂解活化作用有關(guān)。利用哺乳動物雙雜交系統(tǒng)分析結(jié)果顯示,TMPRSS2和MSPL不但激活親本株的S蛋白,還對不完全依賴胰酶的適應(yīng)細(xì)胞株的S蛋白具有激活效果,促進(jìn)細(xì)胞膜的融合。通過對仔豬小腸組織TTSPs表達(dá)水平的檢測,結(jié)果顯示四種TTSPs均有表達(dá);而在感染PEDV的小腸組織上,TTSPs相對表達(dá)水平均略有增高,這可能是PEDV為了在體內(nèi)更好的感染和復(fù)制,誘導(dǎo)機(jī)體上調(diào)表達(dá)TTSPs的結(jié)果。綜上所述,本研究篩選出TMPRSS2和MSPL可有效促進(jìn)有胰酶依賴性的PEDV在不添加胰酶的Vero細(xì)胞上的復(fù)制,并進(jìn)一步證實TMPRSS2和MSPL對S蛋白具有裂解催化活性,可以激活病毒粒子侵入宿主細(xì)胞、促進(jìn)膜融合從而利于病毒的繁殖復(fù)制。本研究揭示了TTSPs與PEDV S蛋白互作的分子機(jī)制及其對PEDV復(fù)制的影響,為提高病毒繁殖滴度、擴(kuò)大病毒產(chǎn)量、提高流行毒株體外培養(yǎng)適應(yīng)性提供新的思路。
[Abstract]:Porcine epidemic diarrhea ( PED ) is caused by porcine epidemic diarrhea virus ( PEDV ) . It is an acute and highly contagious intestinal infectious disease characterized by vomiting , diarrhea and dehydration in pigs . In order to study the effect of PEDV isolate LJB / 03 P146 on Vero cells , the results showed that the PEDV isolates could be stably passaged on Vero cells without pancreatin , and the effect of LJB / 03 P146 on Vero cells was observed . The results showed that the cleavage activity of the S - protein could be enhanced by the cleavage of PEDV - S protein . The results showed that the cleavage activity of the S - protein could promote the fusion of PEDV - dependent strains and the host cell membrane .

【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.651

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1466421