發(fā)布時(shí)間：2018-01-21 16:16

  本文關(guān)鍵詞： PEDV 豬整合素αvβ3 多克隆抗體 真核表達(dá)載體　出處：《黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：豬流行性腹瀉(PED)是一種發(fā)病率和死亡率極高的腸道傳染病,給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前已經(jīng)證明豬氨基肽酶N(pAPN)是PEDV的一個(gè)細(xì)胞受體,但是僅依賴于pAPN蛋白仍不能解釋PEDV感染中存在的相關(guān)理論問題。因此,對(duì)PEDV受體的研究具有重要的科學(xué)意義,為抗病毒藥物的研究提供依據(jù)。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)整合素可以作為許多病毒的受體,具有成為共性受體蛋白的趨勢(shì)。在本研究中,根據(jù)GenBank發(fā)表的豬整合素αv和豬整合素β3氨基酸序列,分別進(jìn)行疏水性分析,截取具有親水性的胞外區(qū)氨基酸序列,然后針對(duì)大腸桿菌具有偏嗜性的密碼子進(jìn)行優(yōu)化,人工合成兩段基因。將兩段基因分別連接至pGEX-6p-1原核表達(dá)載體,以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。將成功表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化,然后按照50?g/只的劑量免疫8周齡的BALB/c雌性小白鼠,第3次免疫3日后進(jìn)行眼球采血。用間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià),然后利用Western blot方法鑒定制備的兩種多克隆抗體是否能識(shí)別ST細(xì)胞、IEC細(xì)胞、PK15細(xì)胞及仔豬小腸組織中的整合素蛋白。將人工合成的豬整合素αv和豬整合素β3全基因序列連接至pCAGGS-HA真核表達(dá)載體上,再將重組質(zhì)粒pCAGGS-pIαv和pCAGGS-pIβ3轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞,確定重組蛋白表達(dá)后接種PEDV,在接種病毒后的不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞感染率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果成功獲得了人工合成基因,通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得了重組蛋白pGEX-6p-1-αv和重組蛋白pGEX-6p-1-β3,Western blot顯示截取的豬整合素αv第37~557位氨基酸具有較好的抗原性,豬整合素β3第30~714位氨基酸具有較好的抗原性。制備的豬整合素αv和豬整合素β3多克隆抗體效價(jià)分別為1:6 400和1:12 800,能識(shí)別ST細(xì)胞、IEC細(xì)胞、PK15細(xì)胞及仔豬小腸組織中的整合素蛋白。構(gòu)建了pCAGGS-pIαv和pCAGGS-pIβ3真核表達(dá)載體,共轉(zhuǎn)染組的整合素表達(dá)量高于單轉(zhuǎn)染組,轉(zhuǎn)染后24 h~36 h的整合素αvβ3蛋白在CHO細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量最高,在該時(shí)間段接種PEDV后,過表達(dá)整合素αvβ3蛋白的CHO細(xì)胞PEDV感染率顯著高于對(duì)照組。本研究獲得了豬整合素αv和豬整合素β3多克隆抗體,能夠識(shí)別多種細(xì)胞及組織內(nèi)的天然整合素蛋白,過表達(dá)整合素αvβ3的CHO細(xì)胞使PEDV感染率提高,為PEDV感染機(jī)制及病毒與受體間相互作用的研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Porcine epidemic diarrhea (PED) is an extremely high incidence and mortality of intestinal infectious diseases. It has been proved that porcine aminopeptidase (NPAPN) is a cell receptor of PEDV. However, relying on pAPN protein alone can not explain the related theoretical problems in PEDV infection. Therefore, the study of PEDV receptor has important scientific significance. In recent years, more and more studies have found that integrin can be used as the receptor of many viruses and has the tendency to become a common receptor protein. According to the porcine integrin 偽 v and porcine integrin 尾 3 amino acid sequences published by GenBank, hydrophobic analysis was carried out, and the hydrophilic extracellular amino acid sequences were intercepted. Then the codon of Escherichia coli with bias was optimized and two segments of gene were synthesized. The two genes were linked to the prokaryotic expression vector of pGEX-6p-1 respectively. Expression was induced by IPTG. The recombinant protein was purified and then purified according to 50? BALB/c female mice aged 8 weeks were immunized with g / g for 3 days after the third immunization. The antibody titers were detected by indirect ELISA method. Then Western blot was used to identify whether the two polyclonal antibodies could recognize St cells. The synthetic porcine integrin 偽 v and porcine integrin 尾 3 gene sequences were ligated to the pCAGGS-HA eukaryotic expression vector in PK15 cells and small intestine tissues of piglets. The recombinant plasmids pCAGGS-pI 偽 v and pCAGGS-pI 尾 3 were transfected into CHO cells, and then the recombinant protein was expressed and inoculated with PEDV. The cell infection rate was counted at different time points after inoculation. The recombinant protein pGEX-6p-1- 偽 v and pGEX-6p-1- 尾 3 were obtained by prokaryotic expression system. Western blot showed that the amino acid at position 37557 of porcine integrin 偽 v had good antigenicity. The antibody titers of porcine integrin 偽 v and porcine integrin 尾 3 polyclonal antibody were 1: 6 400 and 1:12 800, respectively. PCAGGS-pI 偽 v and pCAGGS-pI 尾 3 eukaryotic expression vectors were constructed, which could recognize integrin protein in PK15 cells and small intestine tissues of piglets. The expression of integrin in cotransfection group was higher than that in single transfection group. The expression of integrin 偽 v 尾 3 protein in CHO cells was the highest at 24 h and 36 h after transfection. After inoculation with PEDV at that time, the expression of integrin 偽 v 尾 3 protein in CHO cells was the highest. The PEDV infection rate of CHO cells overexpressing integrin 偽 v 尾 3 protein was significantly higher than that of control group. In this study, porcine integrin 偽 v and porcine integrin 尾 3 polyclonal antibodies were obtained. The CHO cells which can recognize the natural integrin protein in many kinds of cells and tissues and overexpression integrin 偽 v 尾 3 increase the infection rate of PEDV. It lays a foundation for the study of the mechanism of PEDV infection and the interaction between virus and receptor.
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.28

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本文編號(hào)：1451961