本文關(guān)鍵詞： 豬 SLC13A5 Wnt10b 克隆 生物信息學(xué) 組織表達(dá)譜 SNP　出處：《湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：[目的]克隆豬SLC13A5和Wnt10b基因cDNA并分別分析其序列及其蛋白的生物學(xué)信息,以及SLC13A5和WntlOb基因分別在25日齡大白豬和沙子嶺豬不同組織中mRNA的表達(dá)水平。[方法]以大白豬為研究對(duì)象,采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA ends, RACE)克隆豬SLC13A5和Wnt10b基因序列,并采用生物信息學(xué)方法對(duì)兩基因cDNA序列及其蛋白功能進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)與分析不同豬種、不同組織中SLC13A5和Wnt10b基因mRNA的表達(dá)水平。利用PCR-RFLP方法在擴(kuò)增目的片段發(fā)現(xiàn)SNP,再對(duì)豬樣進(jìn)行分型,計(jì)算其基因頻率和基因型頻率,然后再對(duì)基因型與達(dá)100kg校正日齡和校正背膘厚進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。[結(jié)論]從大白豬中獲得SLC13A5基因的cDNA全長(zhǎng)為2118 bp,包含一個(gè)1665bp ORF, 5'-UTR 557 bp和3'-UTR 1320 bp,編碼554個(gè)氨基酸；豬SLC13A5基因與其它物種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果表明豬與家綿羊的同源性最近,與獼猴次之,與非洲爪蟾、野鴿和地山雀最遠(yuǎn)；氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白為脂溶性蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量為61183.7 Da,理論等電點(diǎn)pI為7.45;預(yù)測(cè)18個(gè)潛在糖基化位點(diǎn),含有8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域；二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主,三級(jí)結(jié)構(gòu)呈彎曲螺旋結(jié)構(gòu)；采用熒光定量PCR分析得出同一組織SLC13A5基因在25日齡的大白豬和沙子嶺豬表達(dá)差異程度不同,盲腸和背最長(zhǎng)肌中該基因在不同品種差異極顯著(P0.01),肝和腿肌中該基因在不同組織中差異顯著(P0.05),以及同一品種背最長(zhǎng)肌與其它9個(gè)組織差異顯著(P0.05)；通過(guò)PCR-RFLP分析在擴(kuò)增目的片段上發(fā)現(xiàn)突變點(diǎn),該突變點(diǎn)位于A251G處,再對(duì)樣本進(jìn)行基因分型,結(jié)果表明AA、AG和GG三種基因型在校正日齡和校正背膘厚差異不顯著(P0.05)。豬Wnt10b基因cDNA全長(zhǎng)為2075 bp,包括編碼區(qū)1170bp,編碼389個(gè)氨基酸,同源性分析發(fā)現(xiàn)：豬的Wnt10b推測(cè)氨基酸序列與人、黑猩猩、小鼠、褐家鼠、馬、牛、獼猴的同源性94%以上,WntlOb基因在動(dòng)物進(jìn)化中比較保守；氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白質(zhì)相對(duì)分子量為42873.2 Da,理論等電點(diǎn)pI為9.46,屬水溶性蛋白；預(yù)測(cè)含有20個(gè)磷酸化位點(diǎn),預(yù)測(cè)該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含有1個(gè)WNT1結(jié)構(gòu)域,預(yù)測(cè)Wnt10b蛋白在脂肪的代謝和蛋白運(yùn)轉(zhuǎn)中起重要調(diào)節(jié)作用；通過(guò)熒光定量分析結(jié)果表明,背最長(zhǎng)肌(P=0.0042)中Wnt10b基因在大白豬和沙子嶺豬之間差異極顯著(P0.01)；盲腸(P=0.0123)、小腸(P=0.0356)中WNT10B基因在兩豬種表達(dá)量差異顯著(P0.05)；其它組織(腎臟、心臟、肝臟、肺、腿肌)差異不顯著；通過(guò)PCR-RFLP對(duì)樣本進(jìn)行基因分型得出,AA、AG和GG三種基因型在校正日齡和校正背膘厚差異不顯著(P0.05)。[結(jié)論]本研究為進(jìn)一步探討SLC13A5和WntlOb基因在脂肪沉積機(jī)理的研究和脂肪酸代謝提供了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:[Objective] to clone porcine SLC13A5 and Wnt10b gene cDNA and analyze the biological information of their sequences and proteins respectively. And the expression of SLC13A5 and WntlOb gene in different tissues of 25 day old white pig and Shailing pig respectively. [Methods] the cDNA terminal rapid Amplification of cDNA ends was used in large white pigs. The sequence of porcine SLC13A5 and Wnt10b genes was cloned by race, and the functions of cDNA sequences and their proteins were predicted and analyzed by bioinformatics. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect and analyze different pig breeds. The expression level of SLC13A5 and Wnt10b gene mRNA in different tissues. SNPs were found in the amplified target fragment by PCR-RFLP method, and then the porcine samples were typed. The gene frequency and genotype frequency were calculated, and then the genotype was correlated with the corrected age of 100kg and the corrected backfat thickness. [Conclusion: the cDNA of SLC13A5 gene obtained from large white pig is 2118bp, containing a 1665bp ORF. 5r-UTR557bp and 3H-UTR1320bp, encoding 554 amino acids; The phylogenetic tree of porcine SLC13A5 gene and other species showed that pig and domestic sheep had the closest homology, followed by macaques, and furthest from Xenopus laevis, pigeon and tit. Amino acid sequence analysis showed that the protein was fat-soluble, the relative molecular weight was 61183.7 Daand the theoretical isoelectric point Pi was 7.45; Eighteen potential glycosylation sites were predicted, including 8 transmembrane domains. The secondary structure is mainly irregular crimp, and the tertiary structure is curved spiral structure. Fluorescence quantitative PCR analysis showed that the expression of SLC13A5 gene in the same tissue was different in 25-day-old white pigs and Shailing pigs. The difference of the gene in cecum and longissimus dorsi muscle was very significant in different varieties, and in liver and leg muscle, the difference was significant in different tissues (P0.05). There was significant difference between the longissimus dorsi and the other 9 tissues in the same variety (P0.05). The mutation point was found on the amplified target fragment by PCR-RFLP analysis. The mutation point was located at A251G, then genotyped the sample, the result showed that AA. There was no significant difference in corrected age and backfat thickness between AG and GG genotypes. The total cDNA length of porcine Wnt10b gene was 2075 BP, including the coding region of 1170 BP. The deduced amino acid sequence of pig Wnt10b was more than 94% with that of human, chimpanzee, mouse, norvegicus, horse, cattle and macaque. WntlOb gene was conserved in animal evolution. Amino acid sequence analysis showed that the protein encoded by this gene has a relative molecular weight of 42873.2 Daa and a theoretical isoelectric point Pi of 9.46, which is a water-soluble protein. The prediction contains 20 phosphorylation sites and a WNT1 domain in the secondary structure of the protein. It is predicted that the Wnt10b protein plays an important role in fat metabolism and protein translocation. The results of fluorescence quantitative analysis showed that the difference of Wnt10b gene in P0. 0042) between big white pig and Shailing pig was very significant (P 0. 01). There was a significant difference in the expression of WNT10B gene between the two pig species. There was no significant difference in other tissues (kidney, heart, liver, lung, leg muscle). The genotyping of the samples by PCR-RFLP showed that there was no significant difference in the corrected age and backfat thickness between the two genotypes (P 0.05). [Conclusion this study provides a theoretical basis for further study on the mechanism of SLC13A5 and WntlOb genes in fat deposition and fatty acid metabolism.
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S828

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本文編號(hào)：1451440