本文關(guān)鍵詞：H5亞型禽流感病毒HA抗原表位多肽篩選和多肽ELISA檢測抗體方法的建立　出處：《沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：禽流感(Avian influenza, AI)是由A型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)引起的一種主要在禽類中傳播的感染性疾病。AIV感染家禽后可引發(fā)呼吸道疾病,造成產(chǎn)蛋下降,嚴重時可造成100%的死亡率。近年來AIV頻繁變異,使得某些突變毒株可直接感染人類并導(dǎo)致人死亡,嚴重危害公共衛(wèi)生,并且造成巨大經(jīng)濟損失,受到密切關(guān)注�，F(xiàn)地檢測主要通過ELISA試驗雞抗血清中的AIV抗體的存在與否判斷雞群的免疫情況及是否有AIV野毒感染,目前ELISA試驗的包被抗原主要為滅活的H5亞型全病毒或純化的H5亞型HA蛋白,且ELISA試劑盒多為進口,價格高,不利該病的檢測。本研究通過篩選H5亞型HA的特異性抗原表位多肽,并以此作為ELISA試驗的包被抗原,建立可特異性檢測H5亞型AIV HA抗體的ELISA試驗方法,為生產(chǎn)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的ELISA試劑盒打下基礎(chǔ)。在本研究中,以H1-H15亞型流感病毒和新城疫病毒制備了滅活的免疫抗原,并將其免疫SPF雞,獲得抗H1-H15亞型流感病毒和新城疫病毒的免疫血清。將本實驗室保存的H5亞型AIV (A/DuTurkey/England/N28/1973)的HA氨基酸序列作為模板,合成抗原表位多肽,每條抗原表位多肽含有15個氨基酸,并且后一條多肽與前一條重疊14個氨基酸。將合成的H5亞型HA抗原表位多肽固定于固相載體上,與已知血清反應(yīng),通過肽掃描技術(shù),篩選出可與抗H5亞型AIV雞血清特異性反應(yīng)的4條抗原表位多肽,命名為H5-1、H5-2、H5-3、H5-4。將篩選出的H5-1抗原表位多肽包被酶聯(lián)免疫吸附板,通過矩陣試驗確定最佳的抗原包被量及血清樣品稀釋度,并對ELISA試驗的抗原包被、樣品稀釋、二抗稀釋及顯色等試驗條件進行優(yōu)化。以最終確定的ELISA試驗條件分別包被4條H5亞型HA抗原表位多肽并對H1-H15亞型禽流感病毒雞抗血清進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅H5-1抗原表位多肽能有效的將H5亞型禽流感病毒雞抗血清與其他亞型禽流感病毒雞抗血清區(qū)分開,H5-2、H5-3、H5-4則不同程度的受到其他亞型禽流感病毒雞抗血清的干擾,特異性不強。將H5-1抗原表位多肽檢測新城疫病毒雞抗血清,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其不與新城疫病毒雞抗血清發(fā)生反應(yīng)。系列梯度滴定試驗確定該ELISA試驗方法適合檢測1：200倍稀釋的血清樣品,符合性試驗證明對于H5亞型血凝抑制價大于1的樣品血清,該方法陽性檢出率大于87.6%,H5亞型血凝抑制價大于4的樣品血清陽性檢出率98.3%。將H5-1抗原表位多肽分別從氨基端和羧基端進行截短,并將截短多肽對應(yīng)的核酸片段插入原核表達載體pGEX-6p-1,誘導(dǎo)原核表達,通過蛋白免疫印跡(western blot)試驗確定H5-1抗原表位多肽的核心基序為HNIHP。
[Abstract]:Avian influenza virus (AIA) is composed of avian influenza virus type A (Avian influenza virus). AIV) an infectious disease mainly transmitted in poultry. Infection of poultry can lead to respiratory diseases, resulting in a drop in egg laying. In recent years, AIV frequently mutates, which causes some mutant strains to infect human beings directly and lead to human death, seriously endanger public health, and cause huge economic losses. In situ, the presence of AIV antibodies in the sera of chickens tested with ELISA was used to determine the immune status of chickens and whether they had AIV field virus infection. At present, the coating antigen of ELISA test is mainly inactivated H5 subtype virus or purified H5 subtype HA protein, and the ELISA kit is mostly imported, and the price is high. In this study, the specific epitope peptides of H5 subtype HA were screened and used as the coated antigen for ELISA test. To establish a ELISA assay for the specific detection of H5 subtype AIV HA antibody, and to lay a foundation for the production of ELISA kit with independent intellectual property rights. The inactivated immune antigen of H1-H15 influenza virus and Newcastle disease virus was prepared and immunized with SPF chicken. The immune serum against H1-H15 influenza virus and Newcastle disease virus was obtained. The H5 subtype AIV (. The HA amino acid sequence of A / U Turkey / Englandr / N 28 / 1973 was used as a template. Antigenic epitope peptides were synthesized. Each epitope peptide contained 15 amino acids. The latter peptide overlapped with the former one 14 amino acids. The synthesized H5 subtype HA epitope peptide was immobilized on the solid phase carrier and reacted with the known serum. The peptide scanning technique was used. Four antigenic epitopes which could specifically react with anti-H5 subtype AIV chicken serum were selected and named H5-1H5-2H5-3. H5-4. enzyme linked immunosorbent plate (Elisa) was used to determine the best antigen envelope and the dilution of serum samples, and the antigenic envelope of ELISA test was determined by matrix test. Sample dilution. Four HA epitope peptides of H5 subtype were coated with H1-H15 avian influenza virus avian influenza virus antiserum by the final ELISA test conditions, and the antiserum of H1-H15 subtype Avian Influenza virus was injected into the chicken antiserum of H1-H15 subtype Avian Influenza virus (Avian Influenza virus). Check. The results showed that only H5N1 epitope peptide could effectively distinguish H5 subtype avian influenza virus chicken antiserum from other subtype avian influenza virus chicken antiserum. H5-4 was interfered by the chicken antiserum of other subtypes of avian influenza virus, and the specificity of H5-4 was not strong. Detection of Newcastle disease virus chicken antiserum by H5N1 epitope peptide. The results showed that it did not react with Newcastle disease virus chicken antiserum. A series of gradient titration tests confirmed that the ELISA test was suitable for the detection of 1: 200 diluted serum samples. The conformance test showed that the positive rate of this method was more than 87.6% for serum samples with H5 subtype hemagglutination inhibitory value greater than 1. The positive rate of H5 subtype hemagglutination inhibitory value was 98.3%. The H 5-1 epitope peptides were truncated from amino terminal and carboxyl terminal, respectively. Nucleic acid fragments corresponding to truncated peptides were inserted into prokaryotic expression vector pGEX-6p-1 to induce prokaryotic expression. The core motif of H 5-1 epitope peptide was identified as HNIHP by Western blot assay.
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：1435288