發(fā)布時間：2018-01-03 21:12

  本文關鍵詞：2型豬鏈球菌SSU05-0474蛋白的單克隆抗體制備及抗原表位鑒定　出處：《沈陽農(nóng)業(yè)大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 2型豬鏈球菌 SsMps 單克隆抗體 噬菌體展示技術(shù) 抗原表位鑒定

【摘要】：2型豬鏈球菌(Streptococcus suis serotype 2,簡稱SS2)是一種重要的人畜共患病原菌,其感染在全球多個國家發(fā)生,引起人和動物的腦膜炎、敗血癥、關節(jié)炎、心內(nèi)膜炎和中毒性休克綜合征等疾病,呈群發(fā)或散發(fā)流行,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失,對人類健康也構(gòu)成嚴重威脅。為了防治SS2感染,研究者一直致力于其致病機制的研究。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種SS2的毒力因子,包括莢膜多糖、溶菌酶釋放蛋白、溶血素、胞外蛋白因子和表面LPXTG蛋白等。其中存在于菌體表面的LPXTG蛋白,通過其N端錨定于菌體表面,從而在感染過程中首先并直接接觸宿主細胞或蛋白,在致病性中發(fā)揮重要作用。因此,研究LPXTG蛋白的功能是了解SS2致病性的一個重要途徑。經(jīng)過對SS2菌株05ZYH33基因組序列分析發(fā)現(xiàn),基因組編號為SSU05-0474的產(chǎn)物是一種LPXTG蛋白,該蛋白與菌毛骨架蛋白具有較高同源性,因此在本文中簡稱SsMps蛋白(S. suis Major Pili Subunit protein)。據(jù)報道菌毛骨架蛋白在與宿主的相互作用中扮演重要角色,我們的其它研究發(fā)現(xiàn)SsMps具有結(jié)合宿主一種重要免疫因子的能力,因此很可能在SS2致病性中起作用,研究其功能對了解SS2的致病機制具有重要意義。本研究以2型豬鏈球菌標準菌株05ZYH33的基因組DNA為模板,通過PCR擴增出1443bp的ssMps基因,經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I雙酶切后,克隆至表達載體pET22b中,構(gòu)建pET22b/ssMps重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中后,重組菌通過加入終濃度0.8mmol/L的IPTG,22℃條件下誘導表達,蛋白SsMps最終獲得了可溶性表達,表達量約占大腸桿菌BL21(DE3)總蛋白10%,通過親和層析純化獲得較高純度的SsMps蛋白,經(jīng)SDS-PAGE電泳分析,呈現(xiàn)出了一個分子量為45 kDa的蛋白條帶,與預期蛋白大小相符。然后經(jīng)Western-Blot分析驗證,證明成功表達并純化了帶有His標簽的重組蛋白。以該重組蛋白為免疫原,免疫BALB/C雌鼠,利用細胞融合、克隆和篩選等技術(shù),獲得1株抗SsMps重組蛋白的單克隆抗體1D9。Western blot結(jié)果顯示該單克隆抗體能夠特異識別SS2菌體組分中的SsMps蛋白,并通過亞型鑒定試劑盒鑒定亞型,結(jié)果顯示1D9重鏈為IgG1,輕鏈為K鏈,可用于后期對SsMps蛋白功能及應用研究。最后為了鑒定SsMps蛋白的單抗1D9的抗原表位,通過對隨機十二肽噬菌體展示文庫,進行3輪淘選,得到18株能夠有效結(jié)合單抗1D9的陽性噬菌體。測序結(jié)果顯示：7株噬菌體展示的十二肽序列為LPQRRQTRIMII,2株序列為RRHTTRKRMLKT,分別與SsMps蛋白的氨基酸序列162～183位和445～466位氨基酸有一定的相似度。合成這兩段多肽,并經(jīng)過與單抗的結(jié)合實驗以及與SsM ps蛋白競爭結(jié)合單抗1D9實驗,證實這兩段多肽均和天然抗原表位相似,因此推斷單抗1D9識別的抗原表位存在于162～183位和445～466位。
[Abstract]:Streptococcus suis serotype 2 (Streptococcus suis serotype 2, referred to as SS2) is an important zoonotic pathogen, the infection occurred in many countries around the world, cause meningitis, human and animal septicemia, arthritis, endocarditis and toxic shock syndrome and other diseases, a mass or sporadic, causing huge the economic losses to the pig industry, but also pose a serious threat to human health. In order to prevent SS2 infection, the researchers have been devoted to the pathogenic mechanism. It was found that a variety of virulence factors including SS2, capsular polysaccharide, lysozyme release protein, hemolysin, extracellular factor protein and surface LPXTG protein which exists in the. Cell surface LPXTG protein on cell surface by the N anchor, resulting in the infection process and the first direct contact with host cells or proteins that play an important role in pathogenicity. Because of this, the research of LPXTG protein The function is an important way to understand the pathogenicity of SS2. After the 05ZYH33 genome sequence of SS2 strain genome analysis found that the number SSU05-0474 of the product is a kind of LPXTG protein, the protein and pili cytoskeletal proteins with high homology, so in this paper referred to as SsMps (S. suis Major Pili Subunit protein protein). According to reports of pili cytoskeletal proteins in interactions with host plays an important role in other research we found that SsMps is capable of binding to host an important immune factor, so it may play a role in the pathogenicity of SS2, research its function is of great significance to understand the pathogenic mechanism of SS2. In this study, the genomic DNA of Streptococcus suis serotype 2 standard strain 05ZYH33 as template, ssMps gene was amplified by PCR 1443bp, I and Nde by restriction endonuclease Xho I digested and cloned into the expression vector pET22b, construct pET22b The recombinant plasmid /ssMps. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) after recombinant bacteria by adding a final concentration of 0.8mmol/L IPTG, the temperature of 22 DEG C induced expression of SsMps protein, obtained soluble expression, expression of Escherichia coli BL21 accounted for about 10% of total protein (DE3), purified by SsMps protein affinity chromatography analysis by SDS-PAGE electrophoresis, showing a protein with a molecular weight of 45 kDa, consistent with the expected size protein. And then by Western-Blot analysis, proved the successful expression and recombinant protein with His tag was purified. The recombinant protein as immunogen, immune BALB/C mice, using cells fusion, screening and cloning technology, monoclonal antibody 1D9.Western blot results of recombinant anti SsMps protein of 1 strains showed that the monoclonal antibody could specifically recognize SS2 cell components in SsMps protein, and the subtype identification Kit for identification of subtypes, the results showed that 1D9 heavy chain IgG1 and light chain of K chain, can be used for further research of SsMps protein function and application. Finally, in order to epitope identification of SsMps protein monoclonal antibody 1D9, through twelve random peptide phage display library, 3 rounds of panning, 18 strains can be effectively combined positive phage antibody 1D9. The sequencing results showed that twelve strains of phage display peptide sequence 7 for LPQRRQTRIMII, 2 strains of the RRHTTRKRMLKT sequence, and the amino acid sequence of SsMps protein were 162 ~ 183 and 445 ~ 466 amino acids have a certain similarity. Combined these two peptides, and with monoclonal antibody binding experiments and SsM PS and protein binding of monoclonal antibody 1D9 experiments confirmed that these two peptides are natural and epitopes similar, therefore infer mAb 1D9 recognized epitopes present in 162 ~ 183 and 445 ~ 466.

【學位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.611

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