本文關(guān)鍵詞：miR-10a在小鼠精子發(fā)生過(guò)程中的調(diào)控作用　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：Mi RNA是一類長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸,廣泛分布和高度保守的非編碼RNA。它能夠與靶基因?qū)?yīng)的3,-UTR結(jié)合,調(diào)節(jié)其表達(dá)水平。在哺乳動(dòng)物睪丸中存在豐富的micro RNAs,一些mi RNA直接參與生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞的功能,調(diào)控精子發(fā)生過(guò)程。本研究中我們利用Cre-flox P重組酶系統(tǒng)獲得生殖細(xì)胞過(guò)表達(dá)mi R-10a的小鼠,試圖揭示mi R-10a對(duì)小鼠精子發(fā)生過(guò)程的調(diào)控作用。1.生殖細(xì)胞中過(guò)表達(dá)mi R-10a(Mvh-Cre;mi R-10alsl-tetoff,mi R-10a+/-)小鼠表現(xiàn)為精子發(fā)生障礙。利用Mvh-Cre雄鼠與mi R-10alsl-tetoff雌鼠交配,經(jīng)基因分析和q PCR檢測(cè),獲得了生殖細(xì)胞過(guò)表達(dá)mi R-10a(mi R-10a+/-)的小鼠;mi R-10a+/-成年雄鼠睪丸顯著變小,交配試驗(yàn)表現(xiàn)為雄性不育;睪丸組織H.E.染色結(jié)果顯示,出生7天的mi R-10a+/-小鼠曲細(xì)精管內(nèi)沒(méi)有明顯的異常,但在出生10天后,mi R-10a+/-小鼠曲細(xì)精管內(nèi)細(xì)胞顯著減少,成年睪丸曲細(xì)精管上皮空泡化并且精子發(fā)生受阻。2.生殖細(xì)胞過(guò)表達(dá)mi R-10a抑制靶基因Rad51的表達(dá)水平導(dǎo)致減數(shù)分裂阻滯。采用免疫熒光分析顯示,生殖細(xì)胞過(guò)表達(dá)mi R-10a不影響SYCP1和SYCP3的表達(dá)定位;但是γ-H2AX不僅性染色體上,而且在常染色體定位,可能導(dǎo)致染色部位的斷裂損傷修復(fù)受阻;進(jìn)一步分析顯示,mi R-10a+/-小鼠睪丸中Rad51表達(dá)水平顯著下調(diào)。mi R-10a候選靶基因預(yù)測(cè)、通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)以及mi R-10a minics轉(zhuǎn)染3T3、GC-1、Hela、293T細(xì)胞中顯著下調(diào)Rad51的表達(dá),確定Rad51是mi R-10a的一個(gè)靶基因。因此,生殖細(xì)胞過(guò)表達(dá)mi R-10a通過(guò)抑制靶基因Rad51的表達(dá)水平影響減數(shù)分裂期染色斷裂損傷修復(fù),導(dǎo)致減數(shù)分裂阻滯。3.生殖細(xì)胞過(guò)表達(dá)mi R-10a抑制精原干細(xì)胞分化。出生7天的mi R-10a+/-小鼠,其睪丸組織Mvh、GATA4、Stra8和PLZF雙熒光染色顯示,Mvh陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)于GATA4陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少,但是PLZF陽(yáng)性細(xì)胞似乎沒(méi)有明顯變化,表明位于基底膜的精原干細(xì)胞數(shù)量不變,而分化的生殖細(xì)胞數(shù)量減少。4.生殖細(xì)胞過(guò)表達(dá)mi R-10a導(dǎo)致睪丸細(xì)胞極性紊亂可能影響生殖細(xì)胞分化。分別對(duì)出生第6、10、14和60天的mi R-10a+/-小鼠睪丸進(jìn)行γ-actin和cdc42表達(dá)定位檢測(cè),結(jié)果顯示,與野生型小鼠相比,出生第6天的mi R-10a+/-小鼠睪丸曲細(xì)精管中γ-actin表達(dá)分布沒(méi)有明顯差異;出生第10天后mi R-10a+/-小鼠睪丸曲細(xì)精管中γ-actin表達(dá)低表達(dá);而從出生第6天開始,mi R-10a+/-小鼠睪丸曲細(xì)精管細(xì)胞極性相關(guān)蛋白cdc42在睪丸顯著低表達(dá),這顯示mi R-10a+/-小鼠睪丸生殖細(xì)胞中γ-actin和cdc42表達(dá)受到抑制,這可能是導(dǎo)致mi R-10a+/-小鼠睪丸細(xì)胞極性紊亂影響生殖細(xì)胞分化進(jìn)程。
[Abstract]:Mi RNA is a class of non-coding RNA with a length of about 22 nucleotides, which is widely distributed and highly conserved. It can bind to the 3H-UTR corresponding to the target gene. There are abundant micro RNAss in mammalian testis, and some mi RNA are directly involved in the functions of germ cells and Sertoli cells. In this study, we used Cre-flox P recombinant enzyme system to obtain overexpressed mi R-10a mouse germ cells. This paper attempts to reveal the regulatory effect of mi R-10a on mouse spermatogenesis. 1. Overexpression of mi R-10a Mvh-Creh-Crein in germ cells; Mi R-10alsl-tetoff. Mi R-10a / -) mice showed spermatogenesis disorder. Male Mvh-Cre mice were mated with MI R-10alsl-tetoff female mice. By gene analysis and Q PCR analysis, we obtained the mouse with overexpression of mi R-10aI mi R-10a / -; Mi R-10a /%-the testis of adult male rats were significantly smaller, and the mating test showed male sterility. The results of H.E. staining in testicular tissue showed that there was no obvious abnormality in the seminiferous tubules of the 7-day-old miR-10a / -mouse tubule, but 10 days after birth. The number of cells in the seminiferous tubule of the mouse was significantly decreased. Adult testicular seminiferous tubules vacuolated and spermatogenesis blocked. 2. Overexpression of germ cells mi. R-10a inhibits the expression of target gene Rad51 and results in meiotic arrest. Overexpression of mi R-10a in germ cells did not affect the expression localization of SYCP1 and SYCP3. But 緯 -H2AX not only on sex chromosome, but also on autosomal location, may lead to damage repair of staining site. Further analysis showed that the expression of Rad51 in testis of R10a /-mice was significantly down-regulated, and the prediction of candidate target genes was significantly down-regulated. The expression of Rad51 was significantly down-regulated by double-luciferase report detection and transfection of miR-10a minics into 3T3GC-1HelaF93T cells. Rad51 was identified as a target gene of mi R-10a. Overexpression of mi R-10a in germ cells affected the repair of meiotic staining damage by inhibiting the expression of target gene Rad51. The over expression of mi R-10a inhibited the differentiation of spermatogonial stem cells. Stra8 and PLZF double fluorescent staining showed that Mvh positive cells were significantly decreased compared with GATA4 positive cells, but PLZF positive cells did not appear to change significantly. The results showed that the number of spermatogonial stem cells located in basement membrane was unchanged. However, the number of differentiated germ cells decreased .4. overexpression of mi R-10a in germ cells may affect the differentiation of germ cells. The expression localization of 緯 -actin and cdc42 in the testis of 14 and 60 d mi R-10a /-mice were detected. The results showed that the expression of 緯 -actin and cdc42 were compared with those of wild type mice. There was no significant difference in the expression of 緯 -actin in testicular seminiferous tubule of MI R-10a / -mouse on the 6th day of birth. The expression of 緯 -actin was low in testicular seminiferous tubules 10 days after birth. From the 6th day after birth, the expression of MIR-10a / -mouse testicular tubule cell polarity related protein (cdc42) was significantly lower in the testis. This indicated that the expression of 緯 -actin and cdc42 in testicular germ cells of miR-10a /-mice was inhibited. This may lead to the disturbance of testicular cell polarity in mi R-10 a /-mice and influence the process of germ cell differentiation.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S814

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本文編號(hào)：1375151