本文關(guān)鍵詞：表達PEDV保護性抗原靶向融合肽乳酸桿菌活菌載體的構(gòu)建及其免疫原性分析　出處：《東北農(nóng)業(yè)大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種腸道傳染病,臨床特征為嚴重的腹瀉、嘔吐以及脫水。PED可發(fā)生于各年齡段豬只,但以仔豬最為易感,死亡率高達95%以上。PEDV感染具有明顯的腸嗜性,故通過黏膜免疫可有效預防本病的發(fā)生。為實現(xiàn)良好的腸道黏膜免疫應(yīng)答,本實驗以PEDV S蛋白中能夠誘導機體產(chǎn)生中和抗體的線性表位區(qū)ps420基因片段,定向插入乳酸菌質(zhì)粒表達載體,并電轉(zhuǎn)化乳酸桿菌,以此作為口服制劑探索腸道黏膜對該病的特異性免疫效果。為提高抗原吸收和呈遞效率,在重組乳酸菌表達載體構(gòu)建中引入M細胞靶向肽基因序列co1和樹突狀細胞靶向肽基因序列DCpep,以增強機體的免疫應(yīng)答。以臨床疑似PED腸道內(nèi)容物擴增獲得PEDV S ps420基因片段,將其克隆到pET-32a,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),獲得重組p ET-32a-ps420/BL21。經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測,確定目的蛋白ps420得到表達。純化回收該蛋白,用于檢測脾淋巴細胞的增殖情況。以融合PCR或SOE-PCR方法引入M細胞靶向肽co1編碼基因和樹突狀細胞靶向肽DCpep編碼基因,分別獲得融合基因ps420-co1、ps420-DCpep和ps420-co1-DCpep,將ps420、ps420-co1、ps420-DCpep和ps420-co1-DCpep插入乳酸桿菌組成型表面表達載體p PG-T7g10-PPT中,電轉(zhuǎn)化入干酪乳桿菌L.casei 393中,得到四株陽性重組菌。重組菌分別命名為非靶向重組乳酸桿菌pPG-T7g10-PPT-ps420/L.casei 393、單靶向M細胞重組乳酸桿菌p PG-T7g10-PPT-ps420-co1/L.casei 393、單靶向樹突狀細胞重組乳酸桿菌p PG-T7g10-PPT-ps420-DCpep/L.casei 393和雙靶向M細胞和樹突狀細胞重組乳酸桿菌p PG-T7g10-PPT-ps420-co1-DCpep/L.casei 393。將構(gòu)建的4株重組乳酸桿菌分別于37℃靜置培養(yǎng)約16 h,經(jīng)Western blot檢測,重組菌均在預期位置表達了目的蛋白;激光共聚焦顯微鏡定位檢測結(jié)果顯示,表達ps420蛋白的4株重組菌菌體表面均可見黃綠色熒光,而未表達ps420蛋白的對照菌pPG-T7g10-PPT/L.casei393則未發(fā)現(xiàn)黃綠色熒光,表明重組干酪乳桿菌表達了目的蛋白并被展示于菌體表面。為探討所構(gòu)建的表達PEDV S ps420蛋白的重組干酪乳桿菌對機體免疫應(yīng)答水平的影響,本研究選用BALB/c小鼠為實驗動物,分組口服免疫不同靶向修飾的重組干酪乳桿菌,同時以口服PBS和空載體菌p PG-T7g10-PPT/L.casei 393為對照。免疫分兩種程序進行:一次免疫組和二次免疫組,接種劑量為100μL,含活菌數(shù)1×109 CFU。免疫后隔天收集小鼠新鮮糞便,每周采集小鼠血液、外生殖道黏液等樣品,并在末次免疫兩周后采集每組免疫鼠腸黏液。分別采用不同的方法檢測抗體及細胞因子水平:ELISA檢測黏液和糞便樣品中特異性s IgA抗體水平和血清IgG抗體水平;MTT法檢測脾淋巴細胞增殖情況;試劑盒方法檢測IL-4、IFN-γ的水平。ELISA檢測顯示,表達PEDV S ps420不同靶向修飾的重組乳酸桿菌免疫小鼠在一免后第7d即可檢測到較高的抗體水平,顯著于非靶向修飾重組菌p PG-T7g10-PPT-ps420/L.casei 393免疫組(p0.05),極顯著于對照組(p0.01),且雙靶向修飾重組乳酸桿菌p PG-T7g10-PPT-ps420-co1-DCpep/L.casei 393的免疫效果優(yōu)于單靶向修飾重組乳酸桿菌p PG-T7g10-PPT-ps420-co1/L.casei 393和p PG-T7g10-PPT-ps420-DCpep/L.casei 393;經(jīng)二次免疫后,免疫組抗體水平上升明顯,極顯著于對照組(p0.01)。通過中和實驗可知重組干酪乳桿菌誘導機體產(chǎn)生的血清抗體Ig G具有病毒中和活性。此外,MTT以及IL-4、IFN-γ水平檢測結(jié)果顯示,重組干酪乳桿菌誘導機體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答以Th2型細胞免疫應(yīng)答為主。以上結(jié)果表明,靶向修飾的重組乳酸菌免疫原性強于未經(jīng)修飾的重組乳酸菌,且雙靶向修飾的重組菌的免疫效果最好。綜上所述,本研究構(gòu)建了表達PEDV保護性抗原的重組干酪乳桿菌,并證實M細胞與樹突狀細胞雙靶向策略應(yīng)用于乳酸菌活載體系統(tǒng)可誘導較強的免疫應(yīng)答,為PEDV新型口服疫苗的研制提供了新思路。
[Abstract]:The recombinant plasmid pPG - T7g10 - PPT - pPG - T7g10 - PPT - co1 / L . The results showed that the immune response of recombinant Lactobacillus paracasei induced by recombinant Lactobacillus paracasei was significantly higher than that in the control group ( P 0.01 ) .

【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：1373016