本文關鍵詞：豬戊型肝炎病毒抗體阻斷ELISA檢測方法的建立與應用　出處：《西北農林科技大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是一種人畜共患疾病,戊型肝炎病毒(HE virus,HEV)為其病原。豬是HEV主要的自然儲存宿主,因此,對豬群中HEV感染的檢測對于防控人HE的發(fā)生非常必要。目前,RT-PCR和ELISA是診斷該病的最常用方法,但是RT-PCR技術復雜、成本高,容易污染。而ELISA方法,一方面臨床上大多使用針對人血清中HEV抗體檢測的商品化ELISA試劑盒檢測豬血清,其特異性較差;另一方面以基因3型或4型豬HEV的ORF2和ORF3蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA方法,由于蛋白的純化要求高,易產生假陽性。因此,有必要建立一種敏感性和特異性高的豬HEV抗體檢測方法,從而能夠準確、快速了解豬HEV在豬群中的感染情況,進而制定相關HEV跨種傳播的阻斷技術。本課題用實驗室保存的sORF2-C質粒通過原核表達后,制備了基因4型豬HEV的ORF2蛋白sORF2-C作為包被抗原,制備和HRP標記的抗sORF2-C蛋白的單抗HRP-1E4作為阻斷抗體,建立了豬HEV特異性抗體的阻斷ELISA檢測方法,其結果如下:1.豬HEV ORF2重組蛋白sORF2-C的原核表達與純化將實驗室前期構建的包含編碼豬HEV ORF2蛋白C端268個氨基酸基因的重組質粒,轉化大腸桿菌表達宿主菌BL21(DE3)pLysS,37℃,IPTG誘導表達,然后鎳柱親和層析純化,SDS-PAGE分析,結果發(fā)現(xiàn)s ORF2-C蛋白成功表達,并得到預期大小40 ku蛋白,濃度為7.0μg/μL。2.單克隆抗體的制備,純化與標記以純化的sORF2-C蛋白為免疫原,利用傳統(tǒng)的雜交瘤細胞技術成功制備了抗sORF2-C蛋白的三株單抗1E4,2C7和2G9,親和層析純化后,濃度分別為1.86μg/μL,1.39μg/μL和1.89μg/μL。然后用HRP對純化的單抗進行標記,直接ELISA方法測定三株標記株單抗的效價為1:100-1:1000。3.豬HEV抗體阻斷ELISA檢測方法的建立首先利用豬HEV陽性血清阻斷3株標記單抗與sORF2-C蛋白的免疫反應發(fā)現(xiàn),HRP-1E4的阻斷率最高(60%左右),故選取該單抗為建立阻斷ELISA方法的阻斷抗體。然后通過棋盤滴定法確定了阻斷ELISA的最佳反應條件,其中抗原濃度為20μg/mL(100μL/孔)、HRP-1E4稀釋比例為1:1000、檢測豬血清的稀釋度為1:20;同時利用已知的230份豬HEV陰性血清,確定了該方法的Cut-off值為16.9%。4.阻斷ELISA方法的評價敏感性評價:利用CHN-SD-sHEV分離株攻毒豬后不同天數(shù)的45份血清,分別用間接ELISA與阻斷ELISA檢測。結果顯示,在攻毒后28天,兩種方法均在血清中檢測到抗豬HEV抗體;利用HEV抗體檢測的商品化ELISA試劑盒以及阻斷ELISA同時檢測56份豬HEV陽性血清,兩種方法檢測均為陽性。上述結果表明,建立的阻斷ELSIA敏感性與間接ELISA以及人血清HEV抗體檢測的商品化ELISA試劑盒相同。特異性評價:利用豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV),豬瘟病毒(CSFV),和豬圓環(huán)病毒病(PCV)的三種抗病毒血清來評價阻斷ELISA的特異性。結果顯示,PRRSV,CSFV和PCV抗血清的阻斷率遠遠低于豬HEV陽性血清的阻斷率,因此本方法特異性高。重復性評價:阻斷ELISA的板內、板間的重復性分析發(fā)現(xiàn),板內和板間試驗PI值的變異系數(shù)(CV值)均小于10%,證明本方法的重復性好。與間接ELISA,Western blot和商品化ELISA試劑盒一致性評價:2542份臨床血清樣品分別用阻斷ELISA和間接ELISA方法檢測,其結果一致性為93.23%;選取其中150份血清樣品,分別用Western blot和商業(yè)ELISA試劑盒檢測,結果發(fā)現(xiàn)阻斷ELISA與Western blot和商業(yè)ELISA試劑盒的一致性均在90%以上。生物統(tǒng)計軟件分析,其Kappa值均大于0.45,說明與其他方法一致性高。綜上所述,本課題建立了一種快速、準確的檢測豬HEV抗體的阻斷ELISA方法;與間接ELISA、Western blot以及商業(yè)化ELISA試劑盒具有很高的一致性,可以用于豬群中豬HEV感染的血清學調查。
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4

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本文編號：1329032