本文關(guān)鍵詞：豬戊型肝炎病毒抗體阻斷ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是一種人畜共患疾病,戊型肝炎病毒(HE virus,HEV)為其病原。豬是HEV主要的自然儲(chǔ)存宿主,因此,對(duì)豬群中HEV感染的檢測(cè)對(duì)于防控人HE的發(fā)生非常必要。目前,RT-PCR和ELISA是診斷該病的最常用方法,但是RT-PCR技術(shù)復(fù)雜、成本高,容易污染。而ELISA方法,一方面臨床上大多使用針對(duì)人血清中HEV抗體檢測(cè)的商品化ELISA試劑盒檢測(cè)豬血清,其特異性較差;另一方面以基因3型或4型豬HEV的ORF2和ORF3蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA方法,由于蛋白的純化要求高,易產(chǎn)生假陽(yáng)性。因此,有必要建立一種敏感性和特異性高的豬HEV抗體檢測(cè)方法,從而能夠準(zhǔn)確、快速了解豬HEV在豬群中的感染情況,進(jìn)而制定相關(guān)HEV跨種傳播的阻斷技術(shù)。本課題用實(shí)驗(yàn)室保存的sORF2-C質(zhì)粒通過(guò)原核表達(dá)后,制備了基因4型豬HEV的ORF2蛋白sORF2-C作為包被抗原,制備和HRP標(biāo)記的抗sORF2-C蛋白的單抗HRP-1E4作為阻斷抗體,建立了豬HEV特異性抗體的阻斷ELISA檢測(cè)方法,其結(jié)果如下:1.豬HEV ORF2重組蛋白sORF2-C的原核表達(dá)與純化將實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的包含編碼豬HEV ORF2蛋白C端268個(gè)氨基酸基因的重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21(DE3)pLysS,37℃,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),然后鎳柱親和層析純化,SDS-PAGE分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)s ORF2-C蛋白成功表達(dá),并得到預(yù)期大小40 ku蛋白,濃度為7.0μg/μL。2.單克隆抗體的制備,純化與標(biāo)記以純化的sORF2-C蛋白為免疫原,利用傳統(tǒng)的雜交瘤細(xì)胞技術(shù)成功制備了抗sORF2-C蛋白的三株單抗1E4,2C7和2G9,親和層析純化后,濃度分別為1.86μg/μL,1.39μg/μL和1.89μg/μL。然后用HRP對(duì)純化的單抗進(jìn)行標(biāo)記,直接ELISA方法測(cè)定三株標(biāo)記株單抗的效價(jià)為1:100-1:1000。3.豬HEV抗體阻斷ELISA檢測(cè)方法的建立首先利用豬HEV陽(yáng)性血清阻斷3株標(biāo)記單抗與sORF2-C蛋白的免疫反應(yīng)發(fā)現(xiàn),HRP-1E4的阻斷率最高(60%左右),故選取該單抗為建立阻斷ELISA方法的阻斷抗體。然后通過(guò)棋盤(pán)滴定法確定了阻斷ELISA的最佳反應(yīng)條件,其中抗原濃度為20μg/mL(100μL/孔)、HRP-1E4稀釋比例為1:1000、檢測(cè)豬血清的稀釋度為1:20;同時(shí)利用已知的230份豬HEV陰性血清,確定了該方法的Cut-off值為16.9%。4.阻斷ELISA方法的評(píng)價(jià)敏感性評(píng)價(jià):利用CHN-SD-sHEV分離株攻毒豬后不同天數(shù)的45份血清,分別用間接ELISA與阻斷ELISA檢測(cè)。結(jié)果顯示,在攻毒后28天,兩種方法均在血清中檢測(cè)到抗豬HEV抗體;利用HEV抗體檢測(cè)的商品化ELISA試劑盒以及阻斷ELISA同時(shí)檢測(cè)56份豬HEV陽(yáng)性血清,兩種方法檢測(cè)均為陽(yáng)性。上述結(jié)果表明,建立的阻斷ELSIA敏感性與間接ELISA以及人血清HEV抗體檢測(cè)的商品化ELISA試劑盒相同。特異性評(píng)價(jià):利用豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV),豬瘟病毒(CSFV),和豬圓環(huán)病毒病(PCV)的三種抗病毒血清來(lái)評(píng)價(jià)阻斷ELISA的特異性。結(jié)果顯示,PRRSV,CSFV和PCV抗血清的阻斷率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于豬HEV陽(yáng)性血清的阻斷率,因此本方法特異性高。重復(fù)性評(píng)價(jià):阻斷ELISA的板內(nèi)、板間的重復(fù)性分析發(fā)現(xiàn),板內(nèi)和板間試驗(yàn)PI值的變異系數(shù)(CV值)均小于10%,證明本方法的重復(fù)性好。與間接ELISA,Western blot和商品化ELISA試劑盒一致性評(píng)價(jià):2542份臨床血清樣品分別用阻斷ELISA和間接ELISA方法檢測(cè),其結(jié)果一致性為93.23%;選取其中150份血清樣品,分別用Western blot和商業(yè)ELISA試劑盒檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)阻斷ELISA與Western blot和商業(yè)ELISA試劑盒的一致性均在90%以上。生物統(tǒng)計(jì)軟件分析,其Kappa值均大于0.45,說(shuō)明與其他方法一致性高。綜上所述,本課題建立了一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)豬HEV抗體的阻斷ELISA方法;與間接ELISA、Western blot以及商業(yè)化ELISA試劑盒具有很高的一致性,可以用于豬群中豬HEV感染的血清學(xué)調(diào)查。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.4

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