本文關(guān)鍵詞：H3亞型禽流感病毒中國分離株的遺傳進(jìn)化分析及其致病性的研究　出處：《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：H3亞型流感病毒宿主非常廣泛,除感染自然宿主鳥類外,該亞型病毒可感染豬、犬和馬等多種哺乳動(dòng)物和人類。在中國,活禽市場中的雞、鴨、鵪鶉、珍珠雞、鴿子等家禽長時(shí)間混養(yǎng),為禽流感病毒的傳播、重組和跨種傳播提供了可能。在多種亞型流感病毒共存環(huán)境中,H3亞型流感病毒的重排變異率會(huì)明顯提高,而且,我國H3亞型禽流感病毒的遺傳進(jìn)化和致病性仍有很多未知。本實(shí)驗(yàn)對(duì)2009至2011年間于上海、浙江、江蘇、廣東和河北等地活禽市場采集的家禽的咽拭子進(jìn)行了流感病毒分離,鑒定分型得到7株H3亞型流感病毒,系統(tǒng)命名為A/duck/Shanghai/120-1/2009(H3N8),A/duck/Nanjing/A1591-1/2010(H3N8),A/chicken/Nanjing/B854-2/2011(H3N8),A/duck/Hebei/B1645-2/2011(H3N2),A/duck/Hebei/B1646-2/2011(H3N2),A/duck/Hebei/B1647-1/2011(H3N2)和A/duck/Shanghai/74-1/2009(H3N2)。為進(jìn)一步對(duì)七株病毒進(jìn)行遺傳進(jìn)化和氨基酸序列分子特征的分析,我們提取七株病毒的總RNA,反轉(zhuǎn)錄得到病毒cDNA,使用A型流感病毒通用引物擴(kuò)增出每株病毒的8段基因,測序得到7株分離株的全基因序列。使用Lasergene 7.0軟件編輯分析氨基酸序列分子特征,使用MEGA6.0軟件中的鄰接法分別繪制8段基因的進(jìn)化樹。遺傳進(jìn)化分析表明,除了B854-2/H3N8和A1591-1/H3N8的NA基因?qū)儆诒泵婪种?其他分離株的全部基因都在歐亞分支聚集。值得注意的是,進(jìn)化樹顯示120-1/H3N8的NA基因與流行于韓國的H5N8高致病性毒株的進(jìn)化關(guān)系密切,河北分離株B1645-2/H3N2、1646-2/H3N2和B1647-1/H3N2的PB2,PB1,NP和NS基因出現(xiàn)了同樣的情況。對(duì)分離毒株的氨基酸序列特征進(jìn)行分析,HA基因裂解位點(diǎn)氨基酸序列均為PEKQTR/GLF,表明7株病毒的均為低致病毒性禽流感病毒。HA蛋白226與228位點(diǎn)的氨基酸序列特征說明這些毒株主要識(shí)別禽源α-2,3-唾液酸受體。PB2蛋白上的627和701位分別為E和D,沒有發(fā)現(xiàn)對(duì)哺乳動(dòng)物呈高致病力的氨基酸位點(diǎn)。NA蛋白序列特征表明7株病毒對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑均敏感。B1645-2/H3N2和B1646-2/H3N2毒株的M2蛋白上有S31N突變,表明這兩株病毒可以耐受M2離子通道抑制劑。為研究7株病毒的細(xì)胞生長特性,將7株純化后病毒以0.01 MOI分別感染六孔板中長至80%的MDCK細(xì)胞、A549細(xì)胞和DF1細(xì)胞,使用含有TPCK-Trypsin的無血清高糖DMEM培養(yǎng)液維持。在接毒后12、24、48、72 h分別收集其細(xì)胞上清,每份樣品重復(fù)3次。所有細(xì)胞上清樣品使用9-10日齡的普通雞胚測定其雞胚半數(shù)感染量(EID50),根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清中病毒的滴度(EID50/mL)繪制7株病毒在MDCK、A549和DF1細(xì)胞上的生長曲線。H3N2亞型中B1646-2與B1647-1毒株在感染后48h和72h在A549細(xì)胞上的復(fù)制效率高于其他H3N2亞型毒株。7株病毒在A549和DF1細(xì)胞上復(fù)制時(shí),在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清的病毒滴度都低于MDCK細(xì)胞。為研究這7株H3亞型禽流感病毒分離株對(duì)哺乳動(dòng)物的致病性,分別以106 EID50的劑量經(jīng)鼻腔接種6周齡BALB/c小鼠,記錄接種后0-14天小鼠體重的變化,并對(duì)各組織中的病毒進(jìn)行分離和滴度測定。結(jié)果顯示,7株禽流感病毒都能夠在小鼠的鼻甲骨和肺臟中復(fù)制,但是均不致死小鼠。肺部組織病理結(jié)果顯示,所有的H3病毒引起的輕度支氣管間質(zhì)性肺炎,表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞浸潤和肺泡上皮損傷。同時(shí)為了解這7株H3亞型禽流感病毒對(duì)家禽的致病性,根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹和小鼠致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取B1646-2/H3N2、B854-2/H3N8和120-1/H3N8為代表毒株,以106EID50的劑量經(jīng)鼻腔接種6周齡SPF雞,分別檢測接種后第3、5、7天的咽和泄殖腔拭子和第4天各臟器中的病毒滴度。三株代表毒株對(duì)雞表現(xiàn)為低致病性,只有B1646-2/H3N2能夠在雞體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制并可能會(huì)通過口咽和泄殖腔排毒。總而言之,我國H3亞型禽流感病毒發(fā)生了明顯的基因重組,導(dǎo)致部分毒株中來源于北美分支的N8基因替換了來源于歐亞分支的NA基因;所有H3病毒分離株對(duì)雞和小鼠均表現(xiàn)為低致病性,但是這些病毒不經(jīng)過適應(yīng)就可以在哺乳動(dòng)物模型小鼠的肺和鼻腔中復(fù)制,其對(duì)人類健康的威脅不容忽視。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：1308273