本文關鍵詞：H3亞型禽流感病毒中國分離株的遺傳進化分析及其致病性的研究　出處：《中國農業(yè)科學院》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：H3亞型流感病毒宿主非常廣泛,除感染自然宿主鳥類外,該亞型病毒可感染豬、犬和馬等多種哺乳動物和人類。在中國,活禽市場中的雞、鴨、鵪鶉、珍珠雞、鴿子等家禽長時間混養(yǎng),為禽流感病毒的傳播、重組和跨種傳播提供了可能。在多種亞型流感病毒共存環(huán)境中,H3亞型流感病毒的重排變異率會明顯提高,而且,我國H3亞型禽流感病毒的遺傳進化和致病性仍有很多未知。本實驗對2009至2011年間于上海、浙江、江蘇、廣東和河北等地活禽市場采集的家禽的咽拭子進行了流感病毒分離,鑒定分型得到7株H3亞型流感病毒,系統(tǒng)命名為A/duck/Shanghai/120-1/2009(H3N8),A/duck/Nanjing/A1591-1/2010(H3N8),A/chicken/Nanjing/B854-2/2011(H3N8),A/duck/Hebei/B1645-2/2011(H3N2),A/duck/Hebei/B1646-2/2011(H3N2),A/duck/Hebei/B1647-1/2011(H3N2)和A/duck/Shanghai/74-1/2009(H3N2)。為進一步對七株病毒進行遺傳進化和氨基酸序列分子特征的分析,我們提取七株病毒的總RNA,反轉錄得到病毒cDNA,使用A型流感病毒通用引物擴增出每株病毒的8段基因,測序得到7株分離株的全基因序列。使用Lasergene 7.0軟件編輯分析氨基酸序列分子特征,使用MEGA6.0軟件中的鄰接法分別繪制8段基因的進化樹。遺傳進化分析表明,除了B854-2/H3N8和A1591-1/H3N8的NA基因屬于北美分支外,其他分離株的全部基因都在歐亞分支聚集。值得注意的是,進化樹顯示120-1/H3N8的NA基因與流行于韓國的H5N8高致病性毒株的進化關系密切,河北分離株B1645-2/H3N2、1646-2/H3N2和B1647-1/H3N2的PB2,PB1,NP和NS基因出現(xiàn)了同樣的情況。對分離毒株的氨基酸序列特征進行分析,HA基因裂解位點氨基酸序列均為PEKQTR/GLF,表明7株病毒的均為低致病毒性禽流感病毒。HA蛋白226與228位點的氨基酸序列特征說明這些毒株主要識別禽源α-2,3-唾液酸受體。PB2蛋白上的627和701位分別為E和D,沒有發(fā)現(xiàn)對哺乳動物呈高致病力的氨基酸位點。NA蛋白序列特征表明7株病毒對神經氨酸酶抑制劑均敏感。B1645-2/H3N2和B1646-2/H3N2毒株的M2蛋白上有S31N突變,表明這兩株病毒可以耐受M2離子通道抑制劑。為研究7株病毒的細胞生長特性,將7株純化后病毒以0.01 MOI分別感染六孔板中長至80%的MDCK細胞、A549細胞和DF1細胞,使用含有TPCK-Trypsin的無血清高糖DMEM培養(yǎng)液維持。在接毒后12、24、48、72 h分別收集其細胞上清,每份樣品重復3次。所有細胞上清樣品使用9-10日齡的普通雞胚測定其雞胚半數(shù)感染量(EID50),根據(jù)不同時間點細胞上清中病毒的滴度(EID50/mL)繪制7株病毒在MDCK、A549和DF1細胞上的生長曲線。H3N2亞型中B1646-2與B1647-1毒株在感染后48h和72h在A549細胞上的復制效率高于其他H3N2亞型毒株。7株病毒在A549和DF1細胞上復制時,在各個時間點細胞上清的病毒滴度都低于MDCK細胞。為研究這7株H3亞型禽流感病毒分離株對哺乳動物的致病性,分別以106 EID50的劑量經鼻腔接種6周齡BALB/c小鼠,記錄接種后0-14天小鼠體重的變化,并對各組織中的病毒進行分離和滴度測定。結果顯示,7株禽流感病毒都能夠在小鼠的鼻甲骨和肺臟中復制,但是均不致死小鼠。肺部組織病理結果顯示,所有的H3病毒引起的輕度支氣管間質性肺炎,表現(xiàn)為中性粒細胞浸潤和肺泡上皮損傷。同時為了解這7株H3亞型禽流感病毒對家禽的致病性,根據(jù)系統(tǒng)進化樹和小鼠致病性實驗結果選取B1646-2/H3N2、B854-2/H3N8和120-1/H3N8為代表毒株,以106EID50的劑量經鼻腔接種6周齡SPF雞,分別檢測接種后第3、5、7天的咽和泄殖腔拭子和第4天各臟器中的病毒滴度。三株代表毒株對雞表現(xiàn)為低致病性,只有B1646-2/H3N2能夠在雞體內進行復制并可能會通過口咽和泄殖腔排毒�？偠灾�,我國H3亞型禽流感病毒發(fā)生了明顯的基因重組,導致部分毒株中來源于北美分支的N8基因替換了來源于歐亞分支的NA基因;所有H3病毒分離株對雞和小鼠均表現(xiàn)為低致病性,但是這些病毒不經過適應就可以在哺乳動物模型小鼠的肺和鼻腔中復制,其對人類健康的威脅不容忽視。
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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