本文關(guān)鍵詞：重組病毒rCVS-11-G免疫原的制備及其實(shí)驗(yàn)免疫研究

  更多相關(guān)文章： 狂犬疫苗 佐劑 細(xì)胞免疫 多糖 中和抗體效價

【摘要】：狂犬病是由一種單鏈RNA病毒引起的致死性腦脊髓炎,所有溫血動物和人類普遍對該病毒易感,發(fā)病后死亡率幾乎100%。接種疫苗是預(yù)防狂犬病最主要的手段。目前國內(nèi)主要的人用和獸用狂犬病疫苗是滅活疫苗,滅活疫苗的安全性好,但存在免疫原性差的缺點(diǎn)。提升滅活疫苗的免疫原性主要有兩種渠道:一是選擇免疫原性更好的毒株,二是使用活性好的新型佐劑。本研究將一株通過反向遺傳系統(tǒng)改造后獲得的含有雙G基因的重組狂犬病毒r CVS-11-G經(jīng)細(xì)胞適應(yīng)、培養(yǎng)、滅活后分別與三種多糖(IIP-A-1、IIP-2和PCP-II)復(fù)合后制備免疫原,通過實(shí)驗(yàn)免疫小鼠和犬評價其免疫原性。1.重組狂犬病毒r CVS-11-G的鑒定、細(xì)胞適應(yīng)與培養(yǎng)。重組病毒r CVS-11-G額外插入的G基因表達(dá)穩(wěn)定,不會因?yàn)閭鞔鴣G失;r CVS-11-G能夠在BSR和Vero細(xì)胞上能高效穩(wěn)定地復(fù)制,在BSR細(xì)胞上滴度較為穩(wěn)定,穩(wěn)定在5×108TCID50/m L-109TCID50/m L之間,在Vero細(xì)胞上滴度穩(wěn)定在108 TCID50/m L左右。大量培養(yǎng)r CVS-11-G重組病毒,為免疫原的制備奠定基礎(chǔ)。2.小鼠實(shí)驗(yàn)免疫研究。重組狂犬病毒r CVS-11-G經(jīng)滅活后分別與板藍(lán)根中提取的多糖IIP-A-1、IIP-2和自茯苓中提取的多糖PCP-II復(fù)合后制備免疫原,免疫小鼠。免疫后采血,分離血清。通過FAVN方法測定抗狂犬病毒中和抗體效價;分離外周血單核淋巴細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)測定外周血中B、T淋巴細(xì)胞的活化狀態(tài)。采集小鼠腹股溝淋巴細(xì)胞制備單細(xì)胞PBS懸液,通過流式細(xì)胞術(shù)測定其中B細(xì)胞活化狀態(tài)。采集小鼠脾臟,分離脾細(xì)胞通過ELISpot和胞內(nèi)因子染色測定其脾細(xì)胞中分泌IL-4和IFN-γ的細(xì)胞數(shù);通過ELISA測定脾細(xì)胞分泌IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的數(shù)量。最后通過攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)以及暴露后免疫實(shí)驗(yàn)評價該免疫原是否能夠保護(hù)小鼠應(yīng)對狂犬病毒街毒株致死劑量的攻擊。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,通過與最常用的鋁膠佐劑對比,r CVS-11-G復(fù)合三種多糖均后能夠誘導(dǎo)較高的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫,效果好于鋁膠佐劑,且能保護(hù)更多的小鼠免受致死劑量的狂犬病毒街毒株的攻擊。3.犬實(shí)驗(yàn)免疫研究。選擇佐劑活性最好的多糖PCP-II,復(fù)合滅活重組狂犬病毒r CVS-11-G制備免疫原后免疫犬,進(jìn)行加強(qiáng)免疫實(shí)驗(yàn)以及梯度免疫實(shí)驗(yàn)。同時設(shè)立鋁膠佐劑對照組以及梅里亞商品化疫苗對照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該免疫原相比商品化疫苗和鋁膠佐劑組能誘導(dǎo)更強(qiáng)的回憶效應(yīng),產(chǎn)生更快更高的中和抗體效價。犬梯度免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明PCP-II與少量滅活r CVS-11-G結(jié)合制備免疫原后,即可誘導(dǎo)一個較為理想的中和抗體效價,且抗體效價高于相同免疫劑量的鋁膠佐劑組。小結(jié):重組病毒r CVS-11-G額外插入的G基因表達(dá)穩(wěn)定,在BSR和NA細(xì)胞上能高效穩(wěn)定地復(fù)制,病毒滴度在108TCID50/m L-109TCID50/m L之間;相比傳統(tǒng)的鋁膠佐劑,上述三種植物多糖,尤其是PCP-II,結(jié)合滅活重組狂犬病毒r CVS-11-G制備免疫原后,免疫小鼠能誘導(dǎo)的更高的中和抗體效價,活化更多淋巴細(xì)胞的同時,促進(jìn)淋巴細(xì)胞分泌更多的具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子,且能針對狂犬病毒街毒株提供更好的保護(hù)效果;免疫犬后能誘導(dǎo)相比商品化疫苗更高的抗體效價。三種植物多糖,尤其是PCP-II是一種良好的獸用狂犬病疫苗候選佐劑。本研究為一種高效、廉價獸用滅活狂犬疫苗(雙G+糖佐劑)的研發(fā)奠定了前期基礎(chǔ),同時也為人暴露后免疫用狂犬疫苗佐劑的研發(fā)提供了參考數(shù)據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 馮亞龍;趙英永;丁凡;習(xí)志輝;田婷;周帆;杜曉;陳丹倩;魏鋒;程顯隆;林瑞超;;茯苓皮的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展(Ⅰ)[J];中國中藥雜志;2013年07期

2 姜威;朱婷;王玉霞;張振學(xué);單俊杰;;多糖佐劑在疫苗中的應(yīng)用[J];中國新藥雜志;2012年13期

3 唐青,趙秀芹,陶曉霞;中國人間狂犬病流行近況分析[J];中華流行病學(xué)雜志;2001年01期

4 林海祥;鋁佐劑對實(shí)驗(yàn)狂犬病疫苗的影響[J];中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志;1999年02期

，

本文編號：1303999