本文關(guān)鍵詞：TLRs介導(dǎo)M.bovis感染牛乳腺上皮細(xì)胞調(diào)控機(jī)制研究

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【摘要】：奶牛乳腺炎為奶牛多發(fā)病,在奶牛疾病中占有較高的比例。奶牛養(yǎng)殖業(yè)中,每年因乳腺炎造成的損失巨大。牛支原體(Mycoplasma bovis,M.bovis)作為乳腺炎重要的病原,感染后具有發(fā)病時(shí)間長(zhǎng)、感染率高的特點(diǎn),并且常伴發(fā)關(guān)節(jié)炎等疾病。眾所周知,M.bovis缺少細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),因而限制了多種高效廣譜抗生素的使用,而且目前實(shí)驗(yàn)性M.bovis疫苗免疫保護(hù)效果差,針對(duì)牛支原體乳腺炎的防治幾近 束手無(wú)策‖,高效防控牛支原體乳腺炎亟需新思路和新策略。奶牛乳腺具有一套完整的防御外來(lái)病原的系統(tǒng),當(dāng)病原微生物感染乳腺后,乳腺天然免疫系統(tǒng)立即啟動(dòng),病原菌經(jīng)過(guò)乳腺乳頭管進(jìn)入乳池后,乳腺內(nèi)部堅(jiān)固的城墻-乳腺上皮細(xì)胞(Bovine mammary epithelial cells,BMECs)開(kāi)始發(fā)揮哨兵的作用。乳腺上皮細(xì)胞含有豐富的的模式識(shí)別受體-TLRs,TLRs可以快速識(shí)別病原相關(guān)分子模式(PAMPs),進(jìn)而激活宿主細(xì)胞啟動(dòng)天然免疫/特異性免疫來(lái)消滅入侵者。研究M.bovis與乳腺上皮細(xì)胞的相互作用,探討M.bovis感染乳腺上皮細(xì)胞后參與的TLRs種類,以及TLRs如何發(fā)揮作用,有助于更好的理解奶牛M.bovis乳腺炎的作用機(jī)制,為其高效防治奠定理論基礎(chǔ)。本試驗(yàn)旨在建立可靠的M.bovis感染奶牛乳腺上皮細(xì)胞的體外模型,通過(guò)對(duì)感染后TLRs信號(hào)通路相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的研究,確定參與調(diào)控M.bovis感染乳腺上皮細(xì)胞的天然免疫組分,為解析M.bovis乳腺炎的作用機(jī)制提供理論依據(jù),同時(shí)也為發(fā)掘干預(yù)奶牛乳腺炎癥藥物的新靶標(biāo)奠定理論基礎(chǔ)。本論文主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:1原代BMECs的提取和鑒定從健康奶牛乳腺組織中提取細(xì)胞,經(jīng)角蛋白18免疫熒光鑒定,以及特異性MUC-1基因PCR擴(kuò)增證實(shí)所提取的細(xì)胞為原代BMECs。所提取BMECs體外培養(yǎng)生長(zhǎng)良好,且無(wú)外源支原體污染。2 M.bovis感染BMECs體外模型的建立M.bovis感染可以促進(jìn)BMECs釋放炎性因子IL-6、TNF-α和趨化因子IL-8。根據(jù)這些細(xì)胞因子的釋放情況,結(jié)合不同感染條件下BMECs的存活率來(lái)確定最佳感染條件。選取乳腺炎源m.bovis臨床分離株39yc感染bmecs,同時(shí)設(shè)置乳腺炎標(biāo)準(zhǔn)株pg45和m.bovis肺炎臨床分離株hb0801為兩個(gè)對(duì)照組感染細(xì)胞,以未感染m.bovis的bmecs為空白對(duì)照(control組),分別以moi=500及1000的感染比(m.bovis:bmecs)感染bmecs,經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)以及mtt實(shí)驗(yàn)確定細(xì)胞存活率,采用qpcr檢測(cè)il-6、il-8和tnf-α的變化規(guī)律,結(jié)果表明:(1)感染組在moi為500及1000時(shí),與control組對(duì)比,bmecs存活率均未見(jiàn)顯著差異;(2)moi=500時(shí),39yc組較control組從感染16h開(kāi)始到24h,il6、tnf-α的表達(dá)量均顯著升高(p0.01),il-8的表達(dá)量極顯著升高(p0.001);pg45組較control組il-6的表達(dá)量20h升高出現(xiàn)差異(p0.05),il-8的表達(dá)量在感染20h時(shí)出現(xiàn)極顯著升高(p0.001),感染后16htnf-α的表達(dá)量開(kāi)始升高(p0.05),到24h升高顯著(p0.001);hb0801組較control組il-6、il-8以及tnf-α在感染24h均升高極顯著(p0.001);(3)moi=1000時(shí),39yc組il-8以及tnf-α的表達(dá)量均在感染16h開(kāi)始升高極顯著(p0.001),il-6升高顯著(p0.01);pg45組較control組il-6和il-8的表達(dá)量在16h開(kāi)始升高極顯著(p0.001),而tnf-α在感染后4h即出現(xiàn)顯著升高(p0.01),16h后出現(xiàn)極顯著升高(p0.001);hb0801組較control組il-6、il-8和tnf-α在24h均升高極顯著(p0.001),20h開(kāi)始出現(xiàn)升高顯著;(4)moi=1000時(shí)m.bovis感染bmecs致il-6、il-8和tnf-α表達(dá)量升高的程度較moi=500時(shí)強(qiáng)。從m.bovis感染bmecs后細(xì)胞存活率未見(jiàn)明顯變化,三株m.bovis均誘導(dǎo)bmecs產(chǎn)生il-6、il-8和tnf-α等炎性/趨化因子,且炎性/趨化因子產(chǎn)生量呈現(xiàn)感染時(shí)間和感染劑量依賴性變化,表明bmecs啟動(dòng)了炎性反應(yīng)來(lái)抵抗m.bovis的入侵,成功建立了m.bovis感染bmecs體外模型。3m.bovis觸發(fā)bmecs的tlrs篩選及tlrs交叉對(duì)話三株不同m.bovis感染bmecs24h,以未感染的bmecs為control對(duì)照組,收集不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞,分別采用qpcr和westernblot方法在mrna水平和蛋白水平檢測(cè)感染后觸發(fā)的tlrs種類。qpcr結(jié)果顯示:正常bmecs表達(dá)除tlr8以外的tlrs(tlr1-10);m.bovis感染bmecs,觸發(fā)的tlrs有:tlr1、tlr2、tlr3、tlr6和tlr9,詳細(xì)變化規(guī)律如下:(1)感染后10h,39yc組tlr2、tlr3和pg45組tlr9的mrna表達(dá)量較control組升高極顯著(P0.001),39YC組TLR6升高顯著(P0.05);(2)感染后16h,39YC組TLR2、PG45組TLR6、HB0801組TLR2和TLR6的mRNA表達(dá)量較control組升高極顯著(P0.001);(3)感染后20h,39YC組TLR2及PG45組TLR9的mRNA表達(dá)量較control組升高極顯著(P0.001),39YC組TLR1升高顯著(P0.05);(4)感染后24h,39YC組TLR2表達(dá)量、HB0801組TLR9表達(dá)量及PG45組TLR2和TLR9的表達(dá)量較control組升高極顯著(P0.001);Western-blot結(jié)果顯示:所有感染組中TLR1、TLR2、TLR3、TLR6、TLR9蛋白表達(dá)量較對(duì)照組均表現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達(dá)。M.bovis感染BMECs,每隔2h收集細(xì)胞提取RNA,qPCR檢測(cè)TLR1、TLR2和TLR6的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示:感染后觸發(fā)BMECs TLR1、TLR2和TLR6的表達(dá)呈現(xiàn)一定的規(guī)律,TLR1與TLR2的表達(dá)趨勢(shì)類似,同時(shí)TLR2與TLR6的表達(dá)也存在相似的趨勢(shì)。為進(jìn)一步驗(yàn)證TLRs之間的協(xié)同作用,分別收集M.bovis感染BMECs 16h和20h的細(xì)胞,免疫共沉淀檢測(cè)TLRs之間的相互作用:三株M.bovis感染均能引起TLR1/TLR2的相互作用以及TLR2/TLR6的互作。4 TLRs下游級(jí)聯(lián)信號(hào)通路NF-κB和MAPK的激活TLRs下游信號(hào)通路的激活需要接頭蛋白的信號(hào)傳遞作用,用三株M.bovis感染BMECs,設(shè)置未感染control對(duì)照,提取細(xì)胞mRNA,qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:MyD88和TRIF的表達(dá)量都有不同程度的升高。P-P65的表達(dá)量的升高以及P-IκBα表達(dá)量降低標(biāo)志著NF-κB信號(hào)通路的激活,P-c-Jun表達(dá)量的升高標(biāo)志著MAPK信號(hào)通路的激活。Western blot檢測(cè)M.bovis感染后BMECs P-P65、P-IκBα、P-c-Jun的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明:三株M.bovis感染組P-P65、P-c-Jun的表達(dá)量均比空白control組高,蛋白P-IκBα的表達(dá)量較control組低,且灰度值幾乎為零。PDTC為NF-κB的抑制劑,它作用于細(xì)胞可以使NF-κB信號(hào)通路受阻。采用50μM PDTC預(yù)處理細(xì)胞1h,之后再用M.bovis感染24h,qPCR檢測(cè)炎性因子IL-6和TNF-α的釋放量,結(jié)果顯示:PDTC作用后,M.bovis感染BMECs不會(huì)引起IL-6、TNF-α表達(dá)量的升高,證明M.bovis感染觸發(fā)了NF-κB信號(hào)通路。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.23

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本文編號(hào)：1299987