本文關(guān)鍵詞：禽白血病病毒衣殼蛋白p27生物學(xué)功能的初步研究

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【摘要】：禽白血病(Avianleukosis, AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)引起的家禽重要腫瘤性疾病之一。病毒感染除了引起雞群的直接損害外,還造成嚴(yán)重的免疫抑制,生產(chǎn)力下降,混合感染,繼發(fā)感染等,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。禽白血病病毒編碼的p27基因是禽白血病病毒不同亞群之間的一段高度保守的基因。其編碼病毒的衣殼蛋白p27蛋白,含量高,占病毒總蛋白成分的30%以上,有許多易于檢測的病毒抗原位點(diǎn),是ALV的群特異性抗原。這些研究結(jié)果提示禽白血病病毒的p27基因(ALV-p27)可能在ALV感染宿主細(xì)胞致病過程中發(fā)揮一定的作用�；谶@一設(shè)想,本研究建立了ALV-p27基因絕對定量Real time-PCR檢測方法,為進(jìn)一步為研究禽白血病病毒p27基因的生物學(xué)功能提供必要的技術(shù)方法；同時通過構(gòu)建ALV-p27真核表達(dá)載體,使ALV-p27蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)得以表達(dá),進(jìn)而研究ALV-p27蛋白對宿主細(xì)胞生物學(xué)功能的影響；此外初步篩選了與ALV-p27相互作用的宿主細(xì)胞蛋白,為進(jìn)一步研究ALV-p27蛋白與宿主相互作用的分子機(jī)制提供線索和理論基礎(chǔ)。一、 ALV-p27基因SYBR Green Real time-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用設(shè)計(jì)ALV-p27特異性的熒光定量PCR引物擴(kuò)增目的基因,將目的基因與pGEM-T載體進(jìn)行連接,構(gòu)建p27基因的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品,將鑒定正確的p27基因的質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋,用Real-time PCR方法擴(kuò)增p27基因標(biāo)準(zhǔn)曲線,同時建立檢測病毒衣殼蛋白p27基因的絕對熒光定量PCR方法。利用建立的絕對定量PCR方法檢測6日齡胚胎感染病毒,一日齡出殼雛雞不同組織臟器中p27基因的表達(dá)情況。建立的檢測ALV-p27基因絕對定量PCR的方法為病毒復(fù)制提供精準(zhǔn)定量檢測,為現(xiàn)有病毒p27抗原ELISA檢測提供有效的技術(shù)補(bǔ)充,同時為進(jìn)一步研究ALV-p27的生物學(xué)功能提供了一種技術(shù)手段。二、ALV-p27蛋白抑制細(xì)胞因子的表達(dá)為研究暫態(tài)表達(dá)ALV-p27蛋白的DF1細(xì)胞在受到LPS和Poly (I:C)刺激時,p27蛋白對細(xì)胞免疫反應(yīng)的影響。本研究將p27基因克隆至pcDNA3.1(+)中,構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-p27。將構(gòu)建好的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-p27轉(zhuǎn)染至DF1細(xì)胞中,加入LPS和Poly (I:C)刺激物,分別在1,6,12,24,48小時收集細(xì)胞,利用Real-time PCR檢測DF1細(xì)胞中炎癥因子和抗病毒因子基因表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與空載體轉(zhuǎn)染對照組相比,pcDNA3.1-p27轉(zhuǎn)染DF1細(xì)胞組顯著抑制IFN-p, IL-6, IL-1β, IL-12等細(xì)胞因子的表達(dá)。信號通路關(guān)鍵分子檢測結(jié)果表明,pcDNA3.1-p27的表達(dá)顯著抑制MYD88,IRF-7的表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,ALV編碼的p27蛋白可能通過抑制細(xì)胞中炎癥因子和抗病毒因子基因的表達(dá),從而導(dǎo)致機(jī)體的免疫抑制。其中具體的分子作用機(jī)制還需今后進(jìn)一步深入研究。三、 ALV-p27與宿主細(xì)胞相互作用蛋白的初步篩選為了篩選病毒易感細(xì)胞中與ALV-p27相互作用的宿主蛋白,本研究利用抗p27蛋白特異性單克隆抗體對暫態(tài)表達(dá)p27蛋白的DF1細(xì)胞和HDl 1細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),同時利用ALV感染易感細(xì)胞后進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),將3個實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)的差異蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。其中三組質(zhì)譜結(jié)果均檢測到約71kd和72kd的兩個蛋白條帶,這兩種蛋白分別是葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose-regulated Protein, GRP78)和HSPA8。兩組質(zhì)譜結(jié)果同時檢測到的另外兩個相同的蛋白條帶約73kd和60kd,分別是HSPA9和ATP5A1蛋白。綜合分析所有質(zhì)譜結(jié)果提示GRP78, HSPA8, HSPA9和ATP5A1這4種蛋白可能與ALV-p27在細(xì)胞內(nèi)相互作用,在p27蛋白的生物學(xué)功能中發(fā)揮一定的作用。這些結(jié)果為下一步研究ALV-p27蛋白功能和特性提供了可信的候選蛋白和重要的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.3

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本文編號：1295654