本文關(guān)鍵詞：豬胸膜肺炎放線桿菌OmpD、ApxⅣA蛋白表達及其免疫原性初步研究

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【摘要】：豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)屬于巴氏桿菌科(Pasteurella),放線桿菌屬(Actinobacillus)。可引發(fā)豬胸膜肺炎或胸膜炎,死亡率高,由于APP血清型多,交叉保護力差,目前沒有完全有效的疫苗[1]。為研制高效疫苗,本試驗表達了ApxⅣA和OmpD蛋白并初步研究了其免疫原性。1.OmpD基因的擴增及其生物信息學(xué)分析根據(jù)GeneBank上3型APP全基因中的D15/omp基因序列,設(shè)計一對特異性引物,利用PCR方法擴增獲得了1806 bp基因序列。通過DNAstar比對分析,核苷酸同源性為99.4%~99.8%,氨基酸同源性在98.7%~99.5%之間,同源性極高。生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果表明其抗原性和穩(wěn)定性良好。2.OmpD截短基因原核表達在APP OmpD基因序列擴增基礎(chǔ)上,構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET32a-ompD,并轉(zhuǎn)入Rosetta感受態(tài)細胞,經(jīng)0.4mmol/L IPTG誘導(dǎo)4.5 h,表達出大小約為87 KD帶有His標簽的包涵體蛋白。Western Blot試驗顯示初步純化的蛋白反應(yīng)原性良好,為小鼠免疫試驗提供抗原基礎(chǔ)。3.ApxⅣA蛋白表達及間接ELISA優(yōu)化以2.5μg/m L r ApxⅣA包被酶標板,5%明膠封閉2 h;血清稀釋度為1:50,作用60 min;酶標二抗稀釋度為1:3000,反應(yīng)1.5 h條件最佳。陰陽性血清臨界值為0.697。運用建立的ELISA方法和凝集試驗分別對江西部分地區(qū)規(guī)模化豬場不同階段的147份血清樣品進行檢測,母豬和公豬APP抗體陽性率分別為97.47%、98.73%,肥豬陽性率皆為100%,保育豬陽性率分別為18.75%、12.50%,小豬的陽性率分別為26.19%、7.14%,兩者檢測結(jié)果基本一致,說明建立的ELISA方法具有一定的可行性。4.ApxⅣA和OmpD蛋白免疫原性初步研究本試驗分別表達了ApxⅣA和OmpD蛋白,與弗氏佐劑按照一定比例混合乳化制成亞單位疫苗免疫小鼠,終濃度為100μg/mL。每周采血檢測小鼠抗體水平,三免一周后攻毒觀察小鼠癥狀,另設(shè)甲醛滅活疫苗組、PBS對照組。結(jié)果表明:rApxⅣA組與rApxⅣA+rOmpD組疫苗一免14天后開始產(chǎn)生抗體,apxⅣ抗體效價較高,免疫原性較好;而滅活疫苗組二免14天后開始產(chǎn)生抗體,抗體水平較低。小鼠保護力試驗表明試驗組疫苗有一定的保護力,疫苗Ⅱ組效果最好,疫苗Ⅲ組次之,疫苗I組最差。
【學(xué)位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61

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本文編號：1289852