發(fā)布時間：2017-12-14 14:16

  本文關鍵詞：豬溶素與巖藻糖在紅細胞膜上的相互作用及仔豬免疫試驗

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【摘要】：豬鏈球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一種重要的人畜共患病原性細菌,人感染豬鏈球菌后引起腦膜炎、關節(jié)炎、心肌炎,甚至導致休克死亡。1998年和2005年在我國發(fā)生的兩次豬鏈球菌疫情中鏈球菌中毒性休克綜合征的發(fā)病率明顯高于世界其它國家。目前,豬溶素(Suilysin,SLY)是豬鏈球菌唯一已知的分泌性蛋白質(zhì)毒素,與人發(fā)生鏈球菌中毒性休克綜合征有關,它能裂解紅細胞、刺激巨噬細胞釋放大量炎性細胞因子,也能引起實驗動物產(chǎn)生強烈的炎癥反應。豬溶素也是一種保護性抗原,基因修飾的無毒突變子能刺激小鼠產(chǎn)生免疫保護作用。豬溶素屬于膽固醇依賴性細胞裂解毒素(Cholesterol dependent cytolysins,CDCs),具有CDCs分子的典型晶體結構。CDCs分子以產(chǎn)氣莢膜梭菌溶血素O為原型毒素。長期以來,學界認為CDCs分子結合到細胞膜表面的膽固醇后自動寡聚化形成環(huán)狀復合物,繼而以打孔的方式裂解細胞。但近年來對Intermedilysin(ILY)、Vaginolysin(VLY)及Pneumolysin(PLY)與細胞的相互作用研究打破了膽固醇是CDCs唯一受體的論斷。研究發(fā)現(xiàn)ILY、VLY特異性結合人CD59分子,PLY與Lewis X有較高的親和力,Kd值為1.88×10-5 M。由于SLY~(P353L)突變子不能裂解紅細胞而是凝集紅細胞,而且膽固醇不能完全阻斷SLY~(P353L)與紅細胞膜的結合,說明SLY可能與ILY、VLY等CDCs分子相似,與紅細胞間存在多個結合位點。本研究分析了單糖與SLY的相互作用,并對仔豬進行rSLY~(P353L)亞單位疫苗免疫,結果如下:1.rSLY、rSLY~(P353L)在紅細胞膜上有不同的存在形式將rSLY,rSLY~(P353L)與紅細胞懸液孵育后,收集經(jīng)rSLY裂解的紅細胞膜碎片、rSLY~(P353L)凝集的紅細胞用低滲緩沖液處理后收集膜碎片。將rSLY-膜復合物、rSLY~(P353L)-膜復合物經(jīng)SDS—AGE凝膠電泳后進行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(一抗為兔抗rslyp353ligg),結果顯示,rsly在紅細胞膜上以單體、二聚體及寡聚體形式存在,而rslyp353l在紅細胞膜上僅存在單體形式。2.單糖對rsly、rslyp353l活性的影響分析上述實驗結果并查閱其它文獻資料,初步推測sly可能結合紅細胞表面除膽固醇外的其它受體分子,特別是糖基化受體。用巖藻糖、甘露糖、葡萄糖進行阻斷試驗,結果表明,278mmol/l的三種糖溶液能夠阻斷2haurslyp353l的凝血活性和2hursly的溶血活性;當糖濃度低于139mmol/l時,只有巖藻糖溶液有阻斷作用;當糖濃度低于70mmol/l時三種糖溶液均無阻斷作用。278mmol/l的三種糖溶液均不能阻斷16haurslyp353l的凝血活性和16hursly的溶血活性。因此,巖藻糖溶液的阻斷作用最強。用巖藻糖苷酶水解紅細胞膜表面的巖藻糖殘基后,rslyp353l的凝血活性降低2倍,rsly的溶血活性也有所降低。3.巖藻糖對rsly、rslyp353l與紅細胞膜結合作用的影響將rsly、rslyp353l分別與膽固醇溶液、巖藻糖溶液、膽固醇和巖藻糖混合溶液孵育30min后,加入2%的紅細胞懸液,再孵育1h。收集紅細胞并洗滌,經(jīng)低滲緩沖液裂解后,收集rsly-膜復合物、rslyp353l-膜復合,經(jīng)sds—page電泳及蛋白質(zhì)免疫印跡檢測,結果發(fā)現(xiàn):膽固醇能完全阻斷rslyp353l凝血活性,少量rslyp353l依然可以結合到紅細胞膜上,但結合量少于巖藻糖阻斷組;膽固醇與巖藻糖阻斷組中紅細胞膜上未檢測到rslyp353l。對于rsly有相似的結果,但巖藻糖難以完全阻斷其溶血活性。4.非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳測定rsly、rslyp353l與單糖的親和力制備含巖藻糖、甘露糖、葡萄糖的非變性聚丙烯酰胺凝膠(凝膠濃度12%,單糖濃度110mmol/l),rsly、rslyp353l樣品在冰水混合物浴下電泳,以不含糖的非變性膠為對照。測定rsly、rslyp353l在非變性凝膠中的遷移距離,計算遷移率。結果表明rsly、rslyp353l在含有巖藻糖的凝膠中遷移率分別降低1.7%和2.7%;rsly在含有甘露糖和葡萄糖的凝膠中遷移率均降低了1%,rslyp353l均未降低。5.預測rslyp353l與巖藻糖相互作用的位點通過ncbi和zinc獲取rslyp353l與巖藻糖的晶體結構數(shù)據(jù),利用clcdrugdiscoveryworkbench2計算可知rslyp353l存在9個可能的bindingpockets,與l-fucose晶體結構比對后所最高得分值為93.2%。巖藻糖最佳結合位點可能是在rslyp353l的第一結構域,通過與tyr98,pro99和val150形成氫鍵結合到rSLY~(P353L)分子上。6.仔豬免疫的免疫試驗以氫氧化鋁凝膠為佐劑制備rSLY~(P353L)亞單位疫苗,分三組進行免疫接種試驗:每次接種含50μg rSLY~(P353L)的疫苗,接種兩次;每次接種含150μg rSLY~(P353L)的疫苗,接種兩次;一次性接種含500μg rSLY~(P353L)的疫苗。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測免疫后仔豬血清的抗體效價,結果顯示在高劑量一次接種組沒有檢測到抗體,兩次接種組部分仔豬產(chǎn)生特異性抗體,所產(chǎn)生的抗體動態(tài)特征有差異,最高效價為1:1024。綜上所述,豬溶素與紅細胞膜上的巖藻糖存在較弱的相互作用,以氫氧化鋁膠為佐劑制備的亞單位疫苗能刺激仔豬產(chǎn)生特異性抗體。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4

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本文編號：1288198