發(fā)布時間：2017-12-09 00:08

  本文關(guān)鍵詞：豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白對豬肺泡巨噬細(xì)胞Toll樣受體介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答的調(diào)控

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【摘要】：豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起豬的一種高度傳染性病毒性疾病,被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須上報的動物傳染病之一,我國將其列為二類動物疫病。天然免疫應(yīng)答是機(jī)體對入侵病原體的第一道防線,但目前對CSFV結(jié)構(gòu)蛋白在應(yīng)對機(jī)體天然免疫應(yīng)答機(jī)制中的作用尚不清楚。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)能識別病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),介導(dǎo)天然免疫,產(chǎn)生干擾素(IFNs)、趨化因子和促炎性細(xì)胞因子,以清除入侵的病原微生物。關(guān)于CSFV與TLRs相互作用機(jī)制主要集中于CSFV的感染導(dǎo)致免疫細(xì)胞的激活及Ⅰ型IFNs、促炎性細(xì)胞因子的分泌。本研究分析豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白與TLRs(TLR2、TLR3、TLR4和TLR7)介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答間的關(guān)系,以及對其下游免疫效應(yīng)分子表達(dá)的影響。因此,我們構(gòu)建CSFV結(jié)構(gòu)蛋白慢病毒載體,利用慢病毒包裝系統(tǒng)使CSFV結(jié)構(gòu)蛋白在豬肺泡巨噬細(xì)胞中過表達(dá),檢測其對TLRs及免疫效應(yīng)因子表達(dá)的影響,了解CSFV結(jié)構(gòu)蛋白對豬肺泡巨噬細(xì)胞TLRs介導(dǎo)天然免疫應(yīng)答的影響。研究結(jié)果如下:1.設(shè)計CSFV結(jié)構(gòu)蛋白的引物,在C端引入“Flag”標(biāo)簽,RT-PCR擴(kuò)增得到CSFV結(jié)構(gòu)蛋白(C、Erns(E0)、E1和E2)基因,與慢病毒載體pCD513B連接,獲得4個重組質(zhì)粒pCD513B-C-Flag、pCD513B-Erns-Flag、pCD513B-E1-Flag和pCD513B-E2-Flag。雙酶切鑒定和測序結(jié)果顯示成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。2.利用慢病毒包裝系統(tǒng)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞,產(chǎn)生重組慢病毒。將包裝好的重組慢病毒顆粒感染豬肺泡巨噬細(xì)胞,倒置熒光顯微鏡觀察和Western blot檢測,確定CSFV結(jié)構(gòu)蛋白在豬肺泡巨噬細(xì)胞中過表達(dá)。3.用過表達(dá)CSFV結(jié)構(gòu)蛋白的豬肺泡巨噬細(xì)胞研究結(jié)構(gòu)蛋白與TLRs信號通路間的關(guān)系。結(jié)果表明,C蛋白能增強(qiáng)TLR2、TLR3、TRIF和MyD88的表達(dá),主要通過TLR2和TLR3的信號通路激活天然免疫;Erns蛋白能促進(jìn)TLR3、TRIF和IRF3表達(dá),并抑制MyD88表達(dá),主要影響TLR3信號通路;E1和E2下調(diào)MyD88、IRF7和NF-κB的表達(dá),抑制MyD88介導(dǎo)的TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。綜上所述,本研究構(gòu)建CSFV結(jié)構(gòu)蛋白慢病毒載體,利用慢病毒包裝系統(tǒng)使CSFV結(jié)構(gòu)蛋白在豬肺泡巨噬細(xì)胞中過表達(dá),初步了解了CSFV結(jié)構(gòu)蛋白與TLRs(TLR2、TLR3、TLR4和TLR7)介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答間的關(guān)系,為進(jìn)一步深入研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4

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本文編號：1268344