本文關(guān)鍵詞：支氣管敗血波氏桿菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)hcp基因缺失株的構(gòu)建

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【摘要】：支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)是存在于豬呼吸道中一種重要的革蘭氏陰性病原菌,可引起豬肺炎和豬萎縮性鼻炎(Atrophic rhinitis,AR)。該菌是豬呼吸道疾病綜合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)的重要致病因子之一,且易與其它多種病原微生物發(fā)生混合感染,增加豬群呼吸道疾病的發(fā)病率和復(fù)雜程度,從而給養(yǎng)豬業(yè)帶來經(jīng)濟(jì)損失。Ⅵ型分泌系統(tǒng)(TypeⅥsecretion system,T6SS)是存在于大多數(shù)動(dòng)物革蘭氏陰性細(xì)菌中的一種蛋白分泌系統(tǒng),是一個(gè)固定于胞質(zhì)中且跨越內(nèi)膜、周質(zhì)、外膜的管狀結(jié)構(gòu)復(fù)合體,結(jié)構(gòu)上類似于可收縮的噬菌體尾部。T6SS激活后可轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的效應(yīng)因子到靶細(xì)胞內(nèi),與許多致病菌中與致病性相關(guān)。溶血素共調(diào)節(jié)蛋白(Hemolysin-coregulated protein,Hcp)是T6SS復(fù)合體中重要的管道結(jié)構(gòu)蛋白,也可作為效應(yīng)蛋白發(fā)揮一定的生物學(xué)效應(yīng),是功能性T6SS的標(biāo)識(shí)。以實(shí)驗(yàn)室分離的支氣管敗血波氏桿菌QH0814菌株作為親本株,使用自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)的兩步單交換同源重組的方法,構(gòu)建hcp基因缺失株QH0814Δhcp,對(duì)其基本的生物學(xué)特性進(jìn)行研究。主要研究?jī)?nèi)容如下:1.支氣管敗血波氏桿菌hcp基因缺失株QH0814Δhcp的構(gòu)建以QH0814為模板擴(kuò)增hcp基因上下游同源臂,串聯(lián)構(gòu)建重組自殺性質(zhì)粒p RE-Δhcp,通過接合轉(zhuǎn)移將重組自殺性質(zhì)粒導(dǎo)入親本菌中,利用氯霉素(Cm)抗性基因進(jìn)行篩選獲得單交換接合子,隨后繼續(xù)在無抗性的TSB培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng),促進(jìn)無抗性同源重組的發(fā)生,使用引物進(jìn)行PCR檢測(cè),缺失株只能擴(kuò)增到500bp片段,并對(duì)此片段進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證正確,即獲到hcp基因缺失株QH0814Δhcp。2.支氣管敗血波氏桿菌hcp基因缺失株QH0814Δhcp生長(zhǎng)特性對(duì)缺失株連續(xù)培養(yǎng)50代,使用PCR鑒定缺失片段處未發(fā)生回復(fù)突變,說明該基因缺失后具有一定的遺傳穩(wěn)定性。挑取缺失株和親本株的單菌落,分別接種于TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng),再以1:1000的比例轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)基中,培養(yǎng)過程中每2h取樣檢測(cè)菌液OD600值繪制生長(zhǎng)曲線,發(fā)現(xiàn)親本株與缺失株的生長(zhǎng)無顯著差異,表明在體外培養(yǎng)條件下,hcp基因的缺失對(duì)菌體體外生長(zhǎng)無明顯影響。3.Hcp多克隆抗體的制備及鑒定以QH0814為模板擴(kuò)增hcp基因全長(zhǎng),構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-hcp,轉(zhuǎn)化于BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并使用SDS-PAGE檢測(cè),表達(dá)蛋白以包涵體的形式存在,溶解包涵體并進(jìn)行純化,獲得目的蛋白。將所得的蛋白作為免疫蛋白,免疫5周齡的小鼠,免疫完成后采血清進(jìn)行Western Blot檢測(cè),確定所制備的血清具有反應(yīng)性和特異性。4.支氣管敗血波氏桿菌hcp基因缺失株QH0814Δhcp致病性的研究將親本株與缺失株分別以10~5、10~6、10~7、10~8的劑量腹腔接種于對(duì)5周齡的昆明鼠,記錄死亡情況并計(jì)算LD50的值。結(jié)果顯示,與親本株QH0814比較,缺失株QH0814Δhcp的毒力降低了約2倍。以106 CFU的劑量腹腔接種5周齡的昆明鼠對(duì)血液中的菌量及肺臟和肝臟載菌量進(jìn)行計(jì)算比較。結(jié)果顯示,與親本株相比,QH0814Δhcp在血液中菌量降低了5倍,肺臟的載菌量降低了7倍,肝臟的載菌量降低了4倍。hcp基因缺失后,血液中的菌量和組織中的載菌量均顯著下降,且肺臟下降幅度最大,推測(cè)hcp基因與菌體在機(jī)體內(nèi)定植有一定的關(guān)系。使用小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)以100:1進(jìn)行吞噬實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,隨著作用時(shí)間的推移,細(xì)菌不斷被細(xì)胞吞入。RAW264.7細(xì)胞對(duì)親本株的吞噬率基本較為穩(wěn)定,而對(duì)缺失株的吞噬率逐漸增加,說明hcp基因缺失之后,細(xì)菌更容易被吞噬細(xì)胞吞噬,即更容易被機(jī)體清除。使用豬腎上皮細(xì)胞PK-15進(jìn)行粘附入侵試驗(yàn)。結(jié)果表明,與親本株相比,QH0814Δhcp的粘附能力差異不顯著,而入侵能力顯著降低,大約降低3倍。推測(cè)hcp基因與菌體的侵襲性有一定的關(guān)聯(lián)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61

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