本文關(guān)鍵詞：綿羊ACSL1基因克隆和表達(dá)及其對(duì)脂肪含量的影響

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【摘要】：長鏈脂酰輔酶A合成酶家族(long-chain fatty acyl-CoA synthetases,ACSLs)是哺乳動(dòng)物利用脂肪酸活化催化生成酯酰輔酶A過程中所必需的酶。研究表明ACSLs在甘油三酯、磷脂和膽固醇的合成以及脂肪酸的代謝中具有關(guān)鍵作用。本研究根據(jù)Genebank中已發(fā)表預(yù)測(cè)的綿羊的ACSL1基因的序列信息,通過序列比對(duì),以公共序列為靶序列,設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增出部分編碼區(qū)(Coding sequence,CDS),再采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid amplification of cDNARACE技術(shù)分別向兩端擴(kuò)增,最后克隆得到了長度為2100bp的完整CDS區(qū)2100bp、1481bp的3’端以及部分5’端序列,共3638bp。其中CDS區(qū)共編碼699個(gè)氨基酸,理論分子質(zhì)量為82.76kD,理論等電位點(diǎn)為5.38,為疏水性蛋白,無信號(hào)肽,不屬于分泌蛋白,經(jīng)序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)其與牛和豬的同源性為97%。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)綿羊ACSL1基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄差異,結(jié)果顯示,ACSL1基因在不同的組織中轉(zhuǎn)錄水平不同,肝組織中的轉(zhuǎn)錄量顯著高于其他組織,其他組織的表達(dá)量從高到低依次為心,皮下脂肪,背最長肌,十二指腸,腎,肺,脾,睪丸。利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了綿羊ACSL1基因的RNA干擾載體以及過表達(dá)載體,由脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染體外分離的綿羊前體脂肪細(xì)胞,經(jīng)過G418篩選獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,利用熒光定量PCR檢測(cè)綿羊ACSL1mRNA水平變化,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)載體和RNA干涉載體Ⅰ可有效對(duì)ACSL1基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和調(diào)控。使用甘油三酯試劑盒對(duì)細(xì)胞中甘油三酯含量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示:ACSL1基因過表達(dá)后可顯著提高綿羊前脂肪細(xì)胞的甘油三酯的含量,抑制ACSL1基因表達(dá)后則顯著降低了甘油三酯的含量。表明ACSL1基因可能在調(diào)節(jié)動(dòng)物脂肪代謝中具有重要作用。對(duì)ACSL1基因的多態(tài)性檢測(cè)顯示,第2外顯子在chr.26 13930064位置存在G-A的突變。第14外顯子在chr.26 13929965位置存在C-T的突變。第18外顯子在chr.26 13922514位置存在G-A的突變。在內(nèi)含子中也發(fā)現(xiàn)了5處突變。結(jié)合肉質(zhì)性狀進(jìn)行了相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)第2外顯子的突變位點(diǎn)對(duì)部分脂肪酸及氨基酸含量有影響。第14外顯子的突變位點(diǎn)對(duì)部分氨基酸和營養(yǎng)成分含量有影響。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S826

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1 曹陽;綿羊ACSL1基因克隆和表達(dá)及其對(duì)脂肪含量的影響[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1264318