發(fā)布時間：2017-12-06 01:12

  本文關(guān)鍵詞：圈養(yǎng)食蟹猴腹瀉致病菌的分離鑒定及多重PCR檢測方法的建立

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【摘要】：圈養(yǎng)食蟹猴細菌性腹瀉在臨床上非常普遍。為了認識和了解圈養(yǎng)食蟹猴腹瀉致病菌的種類,本研究首先采取傳統(tǒng)的方法對腹瀉致病菌進行分離純化,然后采用16S rRNA基因序列分析方法對部分細菌進行鑒定；最后對3種腹瀉重要致病菌(沙門氏菌、志賀氏菌和變形桿菌)建立3重PCR檢測方法,并對3重PCR體系反應(yīng)條件進行優(yōu)化。實驗內(nèi)容及結(jié)果如下：1、采用傳統(tǒng)的方法從85份圈養(yǎng)腹瀉食蟹猴的糞便樣品(肛拭子)中分離到112株細菌。利用細菌16S rRNA基因序列的通用引物對其中11株進行PCR擴增,并對擴增產(chǎn)物進行測序鑒定,并對其中10株補充做生化實驗。結(jié)果表明：11株細菌中包括1株未培養(yǎng)細菌,1株沙門氏菌,2株鮑氏不動桿菌,1株奇異變形桿菌,1株普通變形桿菌,1株潘氏變形桿菌,1株金黃色葡萄球菌,1株吉氏庫特氏菌,1株大腸桿菌,1株志賀氏菌。2、本研究針對沙門氏菌fimY基因,志賀氏菌iPaH,以及變形桿菌atpD基因,從參考文獻中選取3對特異性引物組合在一起,建立一種同時檢測沙門氏菌、志賀氏菌和奇異變形桿菌的多重PCR檢測方法,并對多重PCR反應(yīng)條件進行優(yōu)化,以及對這個體系的特異性,敏感性等進行檢驗,最后用優(yōu)化后的3重PCR體系對人工染菌的30份糞便樣品進行檢測。建立的3重PCR檢測體系條件優(yōu)化的結(jié)果表明：最佳體系為40μL;在體系中包含EasyTap PCR SuperMix 20μL;最適合的上、下游引物添加量為：變形桿菌0.7 gL,沙門氏菌和大腸桿菌均為1μL；最適合的退火溫度為58℃；3種菌DNA各1μL；雙蒸加至40μL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30s；58℃退火45 s;循環(huán)數(shù)為35；72℃延伸45 s；72℃再延伸7 min。3、PCR引物特異性實驗結(jié)果顯示：只有加有目的基因的泳道出現(xiàn)特異性條帶。測序結(jié)果比對后表明：擴增序列與沙門氏菌,志賀氏菌,奇異變形桿菌的同源性分別為100%,100%,99%。PCR敏感性試驗結(jié)果顯示：優(yōu)化后的多重PCR體系檢測單一病菌的最低限度為：沙門氏菌1 pg/μＬ；志賀氏菌1 pg/μL；奇異變形桿菌100fg/μL。該多重PCR檢測體系同時檢測三種致病菌的最低檢出量為10 Pg/μL。4、該多重PCR檢測系統(tǒng)對人工染菌樣品檢出率為100%。
【學位授予單位】：廣西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S858.9

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4 李雅s，

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