本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素免疫組化檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

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【摘要】：產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringens)可產(chǎn)生多種致死性的外毒素,容易引發(fā)畜禽的各種產(chǎn)氣莢膜梭菌病,以及人們的食物中毒、創(chuàng)傷性氣性壞疽,嚴(yán)重影響人們身體健康,給各國的養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生造成了一定的損失,因此臨床上產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷非常重要。目前診斷該病的主要方法為病原菌的分離鑒定、腸內(nèi)容物的毒素檢測(cè),產(chǎn)氣莢膜梭菌病主要是由腸源性感染引起,常形成腸源性毒血癥,并不一定形成菌血癥及敗血癥,因此從內(nèi)臟實(shí)質(zhì)器官不一定能分離到細(xì)菌,若只從腸道分離到產(chǎn)氣莢膜梭菌沒有診斷價(jià)值;小鼠中和試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)病動(dòng)物腸內(nèi)容物中的產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素,已逐漸被更加敏感的ELISA方法所代替,但其作為疾病確診的依據(jù)也受到質(zhì)疑;特別是A型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的疾病,腸道內(nèi)α毒素的檢測(cè)及分離到大量產(chǎn)氣莢膜梭菌都不能成為確診的依據(jù),因此迫切需要一種方法能檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病作用以明確診斷。α毒素是各型產(chǎn)氣莢膜梭菌均產(chǎn)生的致死性外毒素,尤其以A型菌所產(chǎn)的α毒素量最多。本研究以A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(NCTC 528)為主要的產(chǎn)毒菌株,進(jìn)行α毒素的高效厭氧產(chǎn)毒,通過Enterotoxaemia ELISA kit、小鼠半數(shù)致死量(LD50)和SDS-PAGE方法測(cè)定所產(chǎn)培養(yǎng)物上清中的α毒素;應(yīng)用所產(chǎn)毒素對(duì)試驗(yàn)家兔進(jìn)行人工腹腔注射、肌肉注射α毒素,及時(shí)采集72h內(nèi)死亡家兔的器官組織:心臟、肺臟、脾臟、腎臟、膀胱、肝臟、胃、小腸、盲腸、大腦、小腦和延腦,制備組織切片,用于后續(xù)病理組織學(xué)檢查和免疫組化方法的優(yōu)化建立。結(jié)果顯示:所制備的同批次α毒素對(duì)小鼠的LD50為2-4.25/m L,對(duì)家兔的最小致死量(MLD)為2 m L,即38倍小鼠LD50;人工注射的α毒素通過血液循環(huán)致使胃絨毛上皮細(xì)胞空泡變性、壞死,小腸、盲腸的腸上皮細(xì)胞壞死、脫落,粘膜下層充血,還致使相關(guān)重要的實(shí)質(zhì)器官組織出現(xiàn)了充血、出血、紅細(xì)胞溶血及主質(zhì)細(xì)胞變性、壞死的急性損傷。本研究以抗重組α毒素雜交瘤細(xì)胞制備的單克隆抗體(2A11)為基礎(chǔ)(抗體效價(jià)達(dá)1:102400),通過對(duì)免疫組化程序中的組織固定、抗原修復(fù)、封閉條件、單抗2A11稀釋度、酶標(biāo)二抗和DAB顯色等多個(gè)試驗(yàn)條件進(jìn)行摸索和優(yōu)化,優(yōu)化建立了單抗介導(dǎo)免疫組化檢測(cè)方法。該方法可特異性的檢測(cè)到人工感染兔心臟、肺臟、脾臟、腎臟、膀胱、肝臟、胃、小腸、盲腸和延腦中的α毒素分布,其中胃、小腸、腎臟組織中的α毒素信號(hào)強(qiáng)度較強(qiáng),主要分布于主質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,這為今后探討產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的致病機(jī)理提供了手段和參考。本試驗(yàn)應(yīng)用建立的免疫組化法,結(jié)合病原分離培養(yǎng)、Multiplex PCR方法,對(duì)2013年10月~2015年9月期間采集的山東省5個(gè)規(guī)�；脠�(chǎng)疑似梭菌性腸炎病例進(jìn)行診斷,結(jié)果顯示:本研究共分離到32株產(chǎn)氣莢膜梭菌,毒素型均為A型,分離率為64%(32/50)。免疫組化檢測(cè)顯示:在50只疑似感染兔的器官組織中,有47只兔可檢測(cè)到α毒素,其陽性檢測(cè)率為94%,在采集的病兔腎臟、肝臟、胃和小腸組織中可檢測(cè)到α毒素陽性信號(hào)。本研究結(jié)果表明:山東省部分地區(qū)規(guī)模化兔場(chǎng)中發(fā)生的5起兔腹瀉疫情與產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染高度相關(guān),94%發(fā)病兔感染了兔梭菌性腸炎,78.7%的發(fā)病兔出現(xiàn)了產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒血癥,流行的產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素型為A型;免疫組化法檢測(cè)疑似梭菌性腸炎病兔組織中α毒素的陽性率顯著高于病原菌的分離率,因此所建的免疫組化法可以彌補(bǔ)常規(guī)病原菌分離鑒定的不足,為本病的診斷提供更加可靠的依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61

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