發(fā)布時間：2017-12-02 02:08

  本文關鍵詞：多表位重組抗原的研制及在日本血吸蟲病診斷和免疫預防上的初步應用

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【摘要】：日本血吸蟲病(schistosomiasis)仍然是我國重要的公共衛(wèi)生問題之一。病牛是我國血吸蟲病最重要的傳染源,在某些流行區(qū)內羊在血吸蟲病傳播中的作用也不可忽視,有效控制牛、羊血吸蟲病對我國早日阻斷血吸蟲病傳播將有重大的意義。診斷是血吸蟲病防控中的中心環(huán)節(jié)。在現(xiàn)已建立的各種血清學診斷技術中,血吸蟲蟲卵可溶性抗原SEA是最常用的診斷抗原,但以SEA作為診斷抗原,往往特異性較差,交叉反應高,不能區(qū)分現(xiàn)癥感染和既往感染以及不能作為療效考核的診斷抗原。一些血吸蟲重組抗原已被用作診斷抗原或疫苗候選分子,評估其應用前景,但大多數(shù)重組抗原獲得的敏感性都低于SEA,誘導的保護效果都不夠高或不穩(wěn)定。多表位重組抗原含有多個抗原表位有可能增強其抗原性和免疫原性,把它們作為診斷抗原或疫苗候選分子,有可能提高診斷方法的敏感性和疫苗的免疫保護效果�；诖�,本文開展了以下幾個方面的研究:1.候選抗原SjPGM和SjRAD23細胞表位的分析及單分子和多表位重組抗原的構建應用BepiPred 1.0、T-epitope Designer、PredictProtein、IEDB Analysis等在線預測軟件預測候選抗原SjPGM和SjRAD23的B細胞和T細胞表位及候選抗原肽段的抗原性、可接近性等,綜合各個預測軟件的分析結果,篩選出表位富集肽段三段,包括從SjPGM挑選出的BSjPGM(aa 85-166);Sj RAD23挑選出的BSj RAD23-1(aa 46-123)和BSjRAD23-2(aa 166-230)。另Sj23抗原的大親水區(qū)(LHD-Sj23)也被引入作為候選表位富集肽段。設計特異性引物,共構建了9種重組原核表達質粒,其中包括4種單分子重組表達質粒:BSjPGM/p ET-28a(+)、BSj RAD23-1/pET-28a(+)、BSjRAD23-2/p ET-28a(+)、BSj23/p ET-32a(+)和5種多表位重組表達質粒:BSjPGM-BSj23/p ET-28a(+)、BSjPGM-BSj RAD23-1/pET-28a(+)、BSjPGM-BSjRAD23-1-BSj23/pET-28a(+)、BSj RAD23-2-BSjPGM-BSj23/p ET-28a(+)和BSj RAD23-2-BSjPGM/pET-28a(+)。除BSjPGM/p ET-28a(+)、BSjRAD23-2/p ET-28a(+)、BSj RAD23-2-BSjPGM/pET-28a(+)外,其余6種重組表達質粒均成功在大腸桿菌中表達,并經(jīng)純化獲得條帶單一的目的蛋白。2.單分子/多表位重組抗原用于診斷山羊血吸蟲病的初步研究以重組抗原rSjPGM和rSj RAD23及新構建的6種表位重組蛋白作為診斷抗原,以sea作為參照抗原,應用間接elisa方法檢測山羊日本血吸蟲病,共檢測91份山羊感染日本血吸蟲血清,44份健康山羊血清,12份捻轉血矛線蟲感染血清及37份東畢吸蟲感染血清。結果顯示,除rbsjpgm-bsjrad23-1外,其余3種多表位重組抗原獲得的敏感性都高于4種單分子重組抗原(rsjrad23,rsjpgm,rbsjrad23-1,rbsj23),其中多表位重組抗原rbsjpgm-bsjrad23-1-bsj23獲得最高的敏感性(97.8%,89/91),且保持良好的特異性(100%,44/44)和較低的交叉反應性(捻轉血矛線蟲:8.33%,1/12;東畢吸蟲13.51%,5/37)。而以sea作為診斷抗原,其敏感性為100%(91/91),但特異性僅為75%(33/44),且與捻轉血矛線蟲和東畢吸蟲分別有25%(3/12)和83.78%(31/37)的交叉反應。本研究結果顯示,多表位重組抗原的研制與應用有可能提高重組抗原檢測山羊血吸蟲病的敏感性,多表位重組抗原rbsjpgm-bsjrad23-1-bsj23有可能是一種診斷山羊血吸蟲病的優(yōu)選抗原。3.單分子/多表位重組抗原用于診斷水牛血吸蟲病的效果評估將在診斷山羊血吸蟲病中顯示出較好效果的5種重組表位抗原,包括2種單分子表位抗原(rbsjrad23-1,rbsj23)和3種多表位重組抗原(rbsjpgm-bsj23、rbsjpgm-bsjrad23-1-bsj23、rbsjrad23-2-bsjpgm-bsj23),用于診斷水牛血吸蟲病,同樣以sea作為參照抗原。共檢測114份日本血吸蟲感染水牛血清,92份健康水牛血清,14份前后盤吸蟲感染血清。elisa結果顯示,5種重組表位抗原中rbsjpgm-bsjrad23-1-bsj23獲得最高的敏感性(95.61%,109/114),其特異性和交叉反應率分別為97.83%(90/92)和7.14(2/14)。而以sea作為診斷抗原,獲得的敏感性為100%,特異性和交叉反應率分別為82.61%(76/92)和50%(7/14)。本研究結果顯示,多表位重組抗原的研制與應用可以提高重組抗原檢測水牛血吸蟲病的敏感性。同樣,多表位重組抗原rbsjpgm-bsjrad23-1-bsj23是水牛血吸蟲病的優(yōu)選診斷抗原。4.表位重組抗原誘導免疫保護效果的初步評價在抗原表位分析基礎上,本研究構建了一重組表達質粒bsjrad23-2-bsjpgm-bsjrad23-1/pet-28a(+),將三種重組表位抗原rbsjrad23-1,rbsjpgm-bsjrad23-1,rbsjrad23-2-bsjpgm-bsjrad23-1結合206佐劑免疫小鼠,結果在兩批獨立的動物實驗中,rbsjrad23-2-bsjpgm-bsjrad23-1在小鼠中誘導的減蟲率(42.7%,30.4%)和減卵率(40.3%,30.3%)均高于另兩種表位重組抗原,本研究提示構建多表位重組抗原可提高重組抗原誘導的免疫保護效果。本研究研制了一種在牛、羊血吸蟲病診斷中具有較高敏感性和特異性的重組多表位診斷抗原r BSj RAD23-2-BSjPGM-BSj RAD23-1,并建立了ELISA檢測技術,為我國家畜血吸蟲病防控提供了一種可選擇的診斷新技術。
【學位授予單位】：上海師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S855.9

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本文編號：1243250