本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的原核表達(dá)及間接ELISA的建立與應(yīng)用

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【摘要】：根據(jù)Gen Bank已登錄的產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素基因序列,設(shè)計(jì)并合成針對(duì)成熟肽的特異性引物。以C型產(chǎn)氣莢膜梭菌總DNA為模板,PCR擴(kuò)增α毒素成熟肽基因片段,構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒p ET-28a(+)-α。通過PCR鑒定、雙酶切鑒定及測序鑒定后,將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、鎳柱親和層析純化蛋白、尿素梯度透析復(fù)性后,Western-blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物。使用復(fù)性的重組蛋白作為包被抗原,通過優(yōu)化間接ELISA的試驗(yàn)條件,確定最佳反應(yīng)條件。正交試驗(yàn)結(jié)果表明,抗原最佳包被濃度為5.0 g/m L,血清的最佳稀釋度為1∶50,酶標(biāo)二抗的最佳稀釋度為1∶5 000。采用已確定的間接ELISA的反應(yīng)條件,對(duì)108份陰性血清的檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,確定了間接ELISA的判定標(biāo)準(zhǔn),即D450≥0.393為陽性,D4500.393為陰性。采用已建立的間接ELISA對(duì)58份陰性血清和50份陽性血清進(jìn)行檢測,結(jié)果表明建立的間接ELISA的特異性為96.5%,敏感性為98%。采用本試驗(yàn)建立的產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗體間接ELISA對(duì)陜西省不同山羊場的521份山羊血清進(jìn)行了檢測,陽性率為92.7%。上述結(jié)果表明,該間接ELISA抗體檢測方法的建立及初步應(yīng)用為產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗體檢測試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院;
【基金】：陜西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2015NY162) 西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)示范站(基地)科技成果推廣項(xiàng)目(TGZX2015-32)
【分類號(hào)】：S852.61
【正文快照】： 產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)又稱魏氏梭菌,在自然界分布廣泛。該菌屬于一種條件致病菌,致病作用主要在于它所產(chǎn)生的毒素。迄今為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的外毒素至少有20種[1],其中主要致死毒素為α、β、ε和ι。根據(jù)產(chǎn)生主要致死毒素(α、β、ε和ι)的不同可將產(chǎn)氣莢膜梭菌

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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7 許崇波,朱平,姚湘燕,馬從林,馮書章;A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素保護(hù)性抗原基因的高效表達(dá)[J];衛(wèi)生研究;1998年S1期

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9 孫佳芝;王新桐;劉雪慧;苗增民;劉志浩;王海榮;柴同杰;;產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2014年06期

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 孫佳芝;產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

2 楊文靜;C型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素蛋白的表達(dá)及其特異性IgY抗體的制備[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：1240310