發(fā)布時(shí)間：2017-11-30 06:42

  本文關(guān)鍵詞：關(guān)嶺牛MSTN基因啟動(dòng)子相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的篩選、克隆及表達(dá)純化

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【摘要】：肌肉生長(zhǎng)抑制素(Myostatin,MSTN),是動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中一個(gè)重要的負(fù)調(diào)控主效基因,MSTN基因具有組織特異性,主要在骨骼肌中特異性表達(dá);肌抑素能調(diào)控肌肉生長(zhǎng)、動(dòng)物脂肪的沉積和骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育,還能影響肌鍵和韌帶的強(qiáng)硬度。轉(zhuǎn)錄因子,即反式作用因子,是指能直接或間接地識(shí)別或結(jié)合在各類(lèi)順式作用元件核心序列上,參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的蛋白質(zhì)。生物體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中,轉(zhuǎn)錄調(diào)控是順式作用元件,如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子與反式作用因子相互作用的結(jié)果。研究蛋白質(zhì)與DNA的相互作用是闡明真核生物基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的基本途徑;生肌決定因子家族蛋白是一種骨骼肌特異性轉(zhuǎn)錄因子,能通過(guò)與肌肉特異性基因調(diào)控區(qū)的結(jié)合,相互協(xié)調(diào)地啟動(dòng)肌肉特異性基因的表達(dá),這是骨骼肌細(xì)胞分化成熟的關(guān)鍵機(jī)制。本研究選擇貴州關(guān)嶺黃牛作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,根據(jù)Gen Bank中牛MSTN基因序列設(shè)計(jì)PCR引物,采用PCR方法擴(kuò)增關(guān)嶺牛MSTN基因啟動(dòng)子區(qū),并利用MSTN基因啟動(dòng)子序列、Promoter-Binding TF Profiling AssayⅡ試劑盒和關(guān)嶺牛肌肉組織的細(xì)胞核提取物,篩選關(guān)嶺牛MSTN基因啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)篩選結(jié)果,克隆關(guān)嶺牛Myo D基因的CDS區(qū),并構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pc DNA3.1(+)-Myo D和重組載體PGL3-MSTN-Pro。將重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染小鼠C2C12細(xì)胞系,檢測(cè)其24h后的雙熒光素酶活性,在細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子Myo D與MSTN啟動(dòng)子的相互作用。構(gòu)建重組原核表達(dá)載體PET32a(+)-Myo D,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌株BL21(DE3),誘導(dǎo)菌株表達(dá)Myo D重組蛋白,純化目的蛋白并Western Blot驗(yàn)證。研究結(jié)果如下:(1)實(shí)驗(yàn)篩選出關(guān)嶺牛MSTN基因啟動(dòng)子區(qū)含有Myo D、MEF2、FOXO1、SMAD、TFIID轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。(2)成功克隆關(guān)嶺牛Myo D基因的CDS區(qū),構(gòu)建重組載體pc DNA3.1(+)-Myo D、PGL3-MSTN-Pro。(3)雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示,在小鼠C2C12細(xì)胞中,實(shí)驗(yàn)組M1/M2比值為對(duì)照組的3.6倍,且兩組數(shù)據(jù)差異極顯著(P0.01)。Myo D蛋白對(duì)MSTN基因啟動(dòng)子活性有增強(qiáng)作用。(4)成功構(gòu)建重組原核表達(dá)載體PET32a(+)-Myo D,并轉(zhuǎn)化至原核表達(dá)菌株BL21(DE3)。(5)成功誘導(dǎo)原核表達(dá)菌株BL21(DE3)表達(dá)重組目的蛋白,純化目的蛋白,Western-blot驗(yàn)證目的蛋白為關(guān)嶺牛Myo D重組蛋白。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S823
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本文編號(hào)：1238375