本文關(guān)鍵詞：弓形蟲熒光定量PCR檢測(cè)方法及HRM分型方法的建立

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【摘要】：弓形蟲病(Toxoplasmosis)是一種呈世界性分布的人獸共患寄生性原蟲病,病原是真球蟲目、肉孢子蟲科、弓形蟲屬的剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)。該蟲可寄生在幾乎所有溫血?jiǎng)游锏挠泻思?xì)胞內(nèi),嚴(yán)重危害人類的健康及畜牧業(yè)的發(fā)展。研究報(bào)道:國內(nèi)豬的弓形蟲感染率從12%~100%不等,病死率可達(dá)60%以上。弓形蟲病正嚴(yán)重危害著中國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。目前,該蟲有三個(gè)國際公認(rèn)的傳統(tǒng)基因型,即TypeⅠ型、Ⅱ型和Ⅲ型,其中TypeⅠ型為強(qiáng)毒基因型,Ⅱ型和Ⅲ型為弱毒基因型。本論文選取TypeⅠ型標(biāo)準(zhǔn)蟲株RH株,Ⅱ型標(biāo)準(zhǔn)蟲株P(guān)RU株及Ⅲ型標(biāo)準(zhǔn)蟲株VEG株作為研究對(duì)象,以致密顆粒蛋白7(GRA7)基因?yàn)榘谢?建立弓形蟲病的熒光定量PCR檢測(cè)方法及弓形蟲三種標(biāo)準(zhǔn)蟲株HRM基因分型方法,為弓形蟲的分子生物學(xué)檢測(cè)、種群遺傳學(xué)及流行病學(xué)調(diào)查奠定基礎(chǔ)。為建立一種弓形蟲病的快速檢測(cè)方法,在弓形蟲致密顆粒蛋白7(GRA7)基因種內(nèi)保守的區(qū)域設(shè)計(jì)種特異性引物,建立弓形蟲病的熒光定量PCR檢測(cè)方法,并應(yīng)用于臨床檢測(cè)。結(jié)果顯示,該檢測(cè)方法特異性強(qiáng),除弓形蟲陽性樣品出現(xiàn)擴(kuò)增外,豬等孢球蟲、豬附紅細(xì)胞體、新孢子蟲、犬鉤蟲、貓藍(lán)氏賈第蟲等沒有擴(kuò)增;操作簡單、快速、從提取樣品基因組到出檢測(cè)結(jié)果全程需時(shí)大概100 min左右;敏感度高、最低可以檢測(cè)到含1個(gè)拷貝靶基因的陽性質(zhì)粒及含10個(gè)速殖子的臨床樣品;穩(wěn)定性好,組內(nèi)及組間Ct值的變異系數(shù)(CV)均小于2%。用所建立的檢測(cè)方法對(duì)廣東地區(qū)9個(gè)規(guī)�；l(fā)病豬場送檢的360份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)并結(jié)合抽樣測(cè)序,結(jié)果顯示該地區(qū)這幾個(gè)規(guī)模化豬場的弓形蟲感染率較高,樣品陽性率高達(dá)63.0%,同時(shí)提醒養(yǎng)殖場畜主要正確及時(shí)使用藥物進(jìn)行控制,加強(qiáng)監(jiān)測(cè),避免爆發(fā)式發(fā)病。該方法對(duì)豬弓形蟲病的流行病學(xué)調(diào)查及其防治具有一定意義。為建立一種弓形蟲三種蟲株的快速基因分型方法,本研究選取弓形蟲致密顆粒蛋白7(GRA7)作為靶基因,采用HRM技術(shù)對(duì)國際公認(rèn)的三個(gè)傳統(tǒng)基因型的標(biāo)準(zhǔn)蟲株(TypeⅠ型RH株、Ⅱ型PRU株和Ⅲ型VEG株)進(jìn)行基因分型。結(jié)果顯示,本研究所設(shè)計(jì)的引物HRM-F和HRM-R,在優(yōu)化的反應(yīng)條件下能明顯區(qū)分TypeⅠ型、Ⅱ型和Ⅲ型。HRM分型方法的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示、三次的組內(nèi)和組間重復(fù)性均良好;敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)樣品濃度低至5×10-4 ng/μL時(shí),HRM分型方法依然可以辨別出基因型。用所建立的分型方法對(duì)9份臨床陽性樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示4份人源樣品和1份魚源樣品為TypeⅡ型,可信度90.82%以上;2份猴源樣品為TypeⅠ型,可信度91.34%以上;其它2份豬源樣品未能定出其基因型,推測(cè)可能其屬于一種地域特有的基因型。本研究所建立的HRM基因分型方法具有快速、穩(wěn)定、敏感和準(zhǔn)確的特點(diǎn),適用于弓形蟲的臨床分類研究和分子流行病學(xué)調(diào)查。
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1227030