本文關(guān)鍵詞：宿主凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白在羊口瘡病毒致炎中的作用研究

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【摘要】：羊口瘡,又稱羊傳染性膿皰皮炎,是由羊口瘡病毒(Orf virus,ORFV)引起的人獸共患傳染病,主要發(fā)生于綿羊、山羊、多種野生動(dòng)物和人。特征性病變是在唇、口、鼻等部位出現(xiàn)紅斑、丘疹、膿皰和痂皮。羊口瘡病毒在世界范圍內(nèi)廣泛分布,凡是養(yǎng)羊地區(qū)均有該病的發(fā)生和流行。中國(guó)除傳統(tǒng)的養(yǎng)羊區(qū)如東北、西北地區(qū)均有該病的發(fā)生和流行外,山東、廣東、云南等地也出現(xiàn)該病的發(fā)生和流行。雖然羊口瘡病毒對(duì)人危害性不大,但是由于其高感染率和分布廣泛,給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。ORFV自身能夠產(chǎn)生抗炎蛋白來逃避宿主免疫反應(yīng),引起宿主重復(fù)發(fā)病。由于缺乏有效的防控措施以及對(duì)ORFV介導(dǎo)宿主免疫和致病機(jī)制了解不足,該病在羊群中頻繁暴發(fā)流行。凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白是炎癥小體重要接頭蛋白,在炎癥小體介導(dǎo)的抵抗病原微生物感染中具有重要作用。目前,還沒有關(guān)于凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白在ORFV感染中的作用研究,這嚴(yán)重妨礙了ORFV介導(dǎo)宿主免疫和致病機(jī)制的深入研究。因此,本文進(jìn)行了如下研究:1、羊口瘡病毒廣東增城株的分離與鑒定利用OFTu細(xì)胞從廣東增城某疑似發(fā)病黑山羊痂皮組織中分離羊口瘡病毒,通過觀察細(xì)胞病變形態(tài)、測(cè)定病毒滴度和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等方法對(duì)分離的毒株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,病料接種于OFTu細(xì)胞后盲傳至第四代出現(xiàn)典型病變;測(cè)得第五代病毒滴度為108.65TCID50/mL;擴(kuò)增出羊口瘡病毒特異性基因ORFV011、ORFV059、ORFV109、ORFV110和ORFV127;系統(tǒng)進(jìn)化分析表明分離的羊口瘡病毒與羊口瘡病毒FJ-DS和FJ-GT親緣關(guān)系較近。以上結(jié)果說明成功分離到羊口瘡病毒,將其命名為ORFV-GDZC株。2、海南黑山羊ASC基因克隆及序列分析運(yùn)用RT-PCR方法擴(kuò)增了海南黑山羊ASC基因,并將其克隆到pMD18-T載體中進(jìn)行測(cè)序,對(duì)獲得的基因序列提交到GenBank,獲得accession no:KM576770。運(yùn)用分子生物學(xué)軟件對(duì)所獲得的序列進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示,所克隆的海南黑山羊ASC基因編碼196個(gè)氨基酸,蛋白分子量約為22.1 kDa。通過DNASTAR軟件對(duì)不同物種的ASC基因序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析,海南黑山羊ASC基因與牛、人、豬、獼猴、小鼠、大鼠、非洲爪蟾和斑馬魚的同源性分別為95.2%、81.3%、83.0%、79.8%、75.4%、75.1%、49.2%、43.7%,該基因在哺乳類動(dòng)物間的同源性高,和兩棲類動(dòng)物間的同源性低,僅有50%。3、海南黑山羊ASC的原核表達(dá)與多抗制備通過雙酶切和序列測(cè)定證明成功構(gòu)建了pET32a(+)-ASC表達(dá)質(zhì)粒。ASC-His標(biāo)簽重組融合蛋白得到有效表達(dá),通過SDS蛋白凝膠電泳檢測(cè)純化蛋白條帶大小約為40kDa,與其預(yù)測(cè)的大小相一致。用His標(biāo)簽抗體和免疫家兔制備的純化IgG抗體分別進(jìn)行Western blot檢測(cè),結(jié)果表明表達(dá)的融合蛋白均為ASC-His標(biāo)簽重組融合蛋白。4、ASC真核過表達(dá)載體和RNAi干擾載體構(gòu)建以克隆質(zhì)粒pMD18-T-C-ASC為模板,設(shè)計(jì)特異性引物,構(gòu)建pIRES2-EGFP-ASC真核過表達(dá)質(zhì)粒。將pIRES2-EGFP-ASC轉(zhuǎn)染OFTu細(xì)胞,經(jīng)熒光顯微觀察和IFA檢測(cè),可觀察到非常強(qiáng)的綠色熒光,表明過表達(dá)載體構(gòu)建成功。利用生物學(xué)軟件,設(shè)計(jì)ASC基因的寡核苷酸引物,構(gòu)建了pSuper-shASC干擾載體。通過shRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)ASC在OFTu細(xì)胞內(nèi)的沉默表達(dá),熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染shRNA-ASC24h內(nèi)ASC mRNA表達(dá)抑制效率達(dá)60%。5、ASC在ORFV感染宿主細(xì)胞致炎中的作用研究首先,利用熒光定量PCR方法對(duì)ORFV感染不同時(shí)間段(1、2、3、4、6、12、24h)OFTu細(xì)胞中ASC基因以及宿主細(xì)胞炎性因子的表達(dá)變化規(guī)律進(jìn)行分析。結(jié)果表明,ASC基因及宿主細(xì)胞炎性因子在病毒感染早期表達(dá)量上調(diào),在感染后2h mRNA表達(dá)量最高,激活了宿主炎癥免疫反應(yīng)。為進(jìn)一步分析ASC在ORFV感染過程中的功能,本研究將ORFV分別感染ASC過表達(dá)及抑制表達(dá)OFTu細(xì)胞,利用熒光定量PCR檢測(cè)宿主炎性因子變化,結(jié)果表明ASC在宿主抗病毒過程中發(fā)揮重要作用。
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1225627