本文關(guān)鍵詞：H9N2亞型禽流感病毒冷適應致弱活疫苗候選株的培育及冷適應表型相關(guān)基因確定

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【摘要】：H9N2亞型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)屬于低致病性,但能引起家禽較為嚴重的疫病,特別是混合感染,導致較高的死亡率。該病毒又可作為其它亞型的流感病毒的供體,形成新的重組病毒。目前國內(nèi)主要采取的預防和控制措施是接種疫苗,而在病毒流行與進化過程中,很容易產(chǎn)生抗原變異,導致疫苗的研制速度跟不上抗原變異的速度,因此有必要研制更加有效的疫苗。冷適應是一種較安全的致弱方法,既保留好的抗原性,又刺激機體產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫。本研究利用H9N2亞型AIV流行株培育了一株冷適應毒株,構(gòu)建了反向遺傳操作系統(tǒng),鑒定出冷適應表型相關(guān)基因,評價了冷適應毒株的免疫效力,為流感病毒疫苗的研制奠定基礎。1.H9N2亞型禽流感病毒冷適應毒株的培育及其生物學特性選取H9N2亞型AIVA/chicken/TaiXing/1/2008 (TX株),在雞胚上從37℃進行連續(xù)梯度降溫傳代,每個溫度傳代8-10次,最終使病毒能夠在25℃下穩(wěn)定的復制,病毒血凝(hemagglutination,HA)效價達到10 1og2。冷適應性(Ca)和溫度敏感性(Ts)試驗證實,冷適應毒株具備Ca特性,最適培養(yǎng)溫度為33℃。為分析冷適應過程中的氨基酸位點變化,通過PCR擴增了冷適應毒株的8個片段基因,并進行測序,與母本毒株的序列對比結(jié)果表明,各個片段都發(fā)生不同程度的突變,位點主要位于HA、PB2、PB1、PA、NP片段。體外增殖實驗表明,冷適應毒株在CEF細胞中能復制,但在MDCK細胞中不能夠正常復制。同時,在小鼠致病性試驗中發(fā)現(xiàn)TX毒株在冷適應過后不能夠引起小鼠的體重下降,試驗表明冷適應過程使病毒的毒力顯著降低。2.H9N2亞型禽流感病毒冷適應減毒株的免疫效力評價為了評價H9N2亞型AIV冷適毒株作為疫苗候選株的潛力。1 06EID50的病毒經(jīng)人工滴鼻、點眼感染SPF雞,試驗表明冷適應毒株失去了接觸傳播能力,但是在氣管組織中能夠低水平復制。冷適應毒株和NS缺失毒株以106EID50劑量滴鼻、點眼途徑免疫4周齡SPF (specific pathogen free)雞,TX毒株經(jīng)過滅活以相同劑量肌肉注射免疫。NS缺失毒株rTX-NS1-128在一次免疫后能夠誘導雞產(chǎn)生較高的血凝抑制價(8.45 log2),能較好抵御同源(TX株)或異源(F98株)H9N2亞型禽流感病毒的攻擊,保護率達到80%以上。而冷適應毒株及TX滅活疫苗一次免疫產(chǎn)生的血凝抑制價只有7.0log2上下,保護率約60%。與NS缺失疫苗株相比都較低,需要加強免疫才能獲得較好的免疫效果。3.H9N2亞型禽流感病毒冷適應株冷適應表型相關(guān)基因測定為了鑒定所培育的H9N2亞型AIV冷適應毒株與冷適應相關(guān)的關(guān)鍵基因,PCR擴增TX-25-CE30毒株的8個基因,并與pHW2000表達載體相連,構(gòu)建出8個基因的表達質(zhì)粒。利用PR8骨架,將冷適應毒株各基因的表達質(zhì)粒逐一替換或組合替換PR8的相應基因,轉(zhuǎn)染MDCK和293T細胞,共獲得12個重組病毒。對重組病毒進行的冷適應特性試驗表明NP、PB1和PB2片段中氨基酸的突變會引起冷適應特性,其中NP片段起關(guān)鍵作用。對NP片段進行進一步定位,發(fā)現(xiàn)NP片段中18位甘氨酸突變?yōu)楣劝彼崮軌蚴共《驹诘蜏叵聫椭啤?br/> 【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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