本文關(guān)鍵詞：雞白痢沙門菌LPS合成相關(guān)基因缺失株的構(gòu)建及免疫效力評(píng)價(jià)

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【摘要】：雞白痢是由雞白痢沙門菌引起,各種日齡雞均可感染的一種急性或慢性傳染病,該病既可水平傳播又可垂直傳播,對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展存在巨大威脅。國家動(dòng)物疫病長期控制規(guī)劃中對(duì)種雞群提出凈化要求,如何有效減少沙門菌的帶菌率是目前亟待解決的問題。疫苗免疫可有效地降低雞群的帶菌率,對(duì)種群的凈化具有積極作用。因此,研制安全、有效的基因缺失疫苗用于區(qū)別自然感染與疫苗免疫顯得尤為重要。關(guān)于沙門菌等革蘭氏陰性菌的研究表明,脂多糖不僅是合成外膜的重要組成部分,也是細(xì)菌發(fā)揮毒力的重要因子。隨著人們對(duì)沙門菌的致病機(jī)理、毒力基因、脂多糖及疫苗應(yīng)用研究的不斷深入,通過基因工程方法制備減毒活疫苗已取得重大成就,并顯示出良好的應(yīng)用前景。本研究利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建雞白痢沙門菌LPS合成相關(guān)基因的缺失株,并對(duì)其相關(guān)生物學(xué)特性進(jìn)行評(píng)價(jià)；其次,通過評(píng)價(jià)各沙門菌缺失株的毒力和免疫效力,為雞白痢沙門菌減毒活疫苗候選株的篩選奠定基礎(chǔ)。1.雞白痢沙門菌LPS合成相關(guān)基因缺失株的構(gòu)建根據(jù)雞白痢沙門菌S6702株的LPS合成相關(guān)基因rfbA、rfbL、rfbJ、rfbI、rfbG、rfbF設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增后利用λ-Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建雞白痢沙門菌缺失株S6702△rfbA、 S6702△rfbL、S6702△rfbJ、S6702△rfbI、S6702△rfbFG和S6702△rfbF。通過PCR擴(kuò)增及序列測定證實(shí)缺失株構(gòu)建成功。生長曲線測定顯示,缺失株與野生株的生長速率無顯著性差異。生物被膜形成能力測定顯示,與野生株相比,S6702△rfbJ和S6702△rfbF的生物膜形成能力無顯著性差異,S6702△rfbA和S6702△rfbI的生物膜形成能力顯著增強(qiáng),而S6702△rfbL和S6702△rfbG的生物膜形成能力顯著減弱。提取脂多糖進(jìn)行SDS-PAGE,結(jié)果表明6株缺失株LPS的分子量相應(yīng)變小,顯示LPS的糖鏈合成受阻,進(jìn)一步證實(shí)缺失突變株構(gòu)建成功。2.雞白痢沙門菌基因缺失株的致病性和免疫原性評(píng)價(jià)通過肌肉接種2日齡SPF雛雞,測定其半數(shù)致死量(LD50),結(jié)果顯示野生株S6702的LD50為3.2×108CFU,缺失株S6702△rfbA、S6702△rfaL、S6702△rfaJ, S6702△rfaI、 S6702△rfaG和S6702△rfaF的LD50分別為1.5×109CFU、1.5×109CFU、1.4×109 CFU、2.2×109CFU、1.0×109CFU、2.5×109CFU, LD50結(jié)果說明缺失株的致病力較野生株均下降。免疫原性評(píng)價(jià)試驗(yàn)中,2日齡SPF雛雞免疫后S6702△rfbA、S6702△rfaL和S6702△rfaG免疫組的體重與健康對(duì)照組相比無顯著差異,S6702△rfaJ, S6702△rfaI和S6702△rfaF免疫組的體重明顯下降。玻板凝集試驗(yàn)證實(shí)野生株血清與S6702抗原產(chǎn)生凝集反應(yīng),缺失株免疫血清與S6702抗原不產(chǎn)生凝集反應(yīng)。利用間接ELISA檢測血清中IgG抗體,免疫10天后IgG抗體水平較低。免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明,對(duì)2日齡SPF雛雞免疫后l0天進(jìn)行野生株S004攻毒,缺失株均能提供完全保護(hù)。將缺失株免疫30日齡SPF雞,利用間接ELISA法檢測血清中抗體,結(jié)果表明加強(qiáng)免疫后所有缺失株均可誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG抗體,玻板凝集試驗(yàn)證實(shí)缺失株免疫血清無凝集抗體產(chǎn)生。因此,S6702△rfbA、S6702△rfaL和S6702△rfaG缺失株具有較好的免疫原性,且不產(chǎn)生凝集抗體。3.雞白痢沙門菌基因缺失株的免疫效力試驗(yàn)根據(jù)免疫保護(hù)評(píng)價(jià)篩選出S6702△rfbA、S6702△rfaL和S6702△rfaG進(jìn)行免疫效力評(píng)價(jià),免疫后7、14和2l天分別采集血清進(jìn)行間接ELISA檢測,免疫后7天可檢測到陽性抗體,第21天IgG抗體陽性率接近100%。采集外周血進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測,結(jié)果顯示,免疫14天后S6702△rfaL免疫組的雞外周血內(nèi)CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比例上升,表明細(xì)胞免疫水平有所提高。疫苗組體內(nèi)分布試驗(yàn)表明,在免疫21天后,在雞肝臟和脾臟內(nèi)的缺失株細(xì)菌基本被清除。免疫保護(hù)試驗(yàn)顯示,S6702△rfbA、S6702△rfaL和S6702△rfaG的保護(hù)率分別為80%、80%和70%。綜上所述,減毒株S6702△rfbA、S6702△rfaL和S6702△rfaG既能誘導(dǎo)SPF雞產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答,又可激活細(xì)胞免疫,具有良好的免疫保護(hù)效果,同時(shí)還不產(chǎn)生血清凝集抗體,可作為雞白痢沙門菌減毒活疫苗候選株。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.31

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本文編號(hào)：1211487