本文關(guān)鍵詞：細胞松弛素B對豬孤雌胚胎DNA甲基化和組蛋白修飾的影響

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【摘要】：細胞松弛素B對豬孤雌胚胎DNA甲基化和組蛋白修飾的影響在胚胎發(fā)育過程中,雌雄原核發(fā)生一系列表觀遺傳變化,擦除來自親本的特異性修飾并建立新的胚胎表觀遺傳模式,其中DNA甲基化和組蛋白修飾在動物胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用,不適當?shù)谋碛^遺傳修飾能引起胚胎發(fā)育異常甚至死亡。細胞松弛素B(Cytochalasin B,CB)是肌動蛋白聚合抑制劑,它能顯著地影響細胞活力,常用于細胞學研究。近年來,CB也常用于哺乳動物體外胚胎實驗中,如CB能誘導四倍體或者二倍體胚胎的形成;在胚胎冷凍中提高存活率;在哺乳動物孤雌胚胎激活中,CB常與其他激活方式協(xié)同作用改善胚胎發(fā)育能力;在體細胞核移植中能避免卵母細胞破碎、保證活化胚胎染色體倍數(shù)。而CB對胚胎發(fā)育過程中表觀遺傳修飾的影響一直少有研究,其影響機制也不得而知。本實驗以豬電激活孤雌胚胎為研究對象,通過在胚胎培養(yǎng)液PZM-3中添加CB,對豬孤雌胚胎發(fā)育中DNA甲基化和組蛋白修飾的變化進行了研究。有研究指出,甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(DNMTi)和組蛋白去乙�；敢种苿�(HDACi)能通過改變DNA甲基化或者組蛋白修飾促進哺乳動物核移植胚胎和孤雌胚胎的發(fā)育。本實驗選用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-Cdr和組蛋白去乙�；敢种苿㏒criptaid與CB共同作用于豬孤雌胚胎,進一步探究三者的協(xié)同作用對豬孤雌胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果如下:1、用不同濃度的CB處理豬卵母細胞孤雌激活胚胎4 h,結(jié)果顯示:5μg/mL、7.5μg/mL和10μg/mL的CB能顯著提高孤雌胚胎的卵裂率(87.48%,88.52%,79.35%),5μg/mL和7.5μg/mL的CB能顯著提高囊胚率(33.31%,33.24%);各濃度CB均能促進囊胚多能性基因Oct4、Sox2、Nanog的表達,5μg/mL組與其他實驗組相比能極顯著上調(diào)Nanog的表達;各濃度CB均能使凋亡相關(guān)基因Bcl-xl、Bax和Casp3的表達顯著降低,5μg/mL組與其他實驗組相比能極顯著的降低Bax的相對表達量;5μg/mL組CB能使囊胚細胞數(shù)明顯上升至51.48個,同時還能顯著降低囊胚細胞凋亡率(7.33%)。根據(jù)以上結(jié)果選用5μg/mL的CB濃度做后續(xù)研究。2、本實驗選用5μg/mL的CB處理豬卵母細胞4 h,利用熒光定量PCR和免疫熒光染色技術(shù)檢測了在孤雌激活胚胎發(fā)育過程中,相關(guān)基因和表觀遺傳標記的表達。結(jié)果顯示,甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b的表達降低,促進5mC向5hmC的轉(zhuǎn)變,說明CB處理能抑制胚胎的甲基化;Hat1和Hdac1的表達在原核時期都顯著降低,AcH3K9的表達明顯上升而H3K9me3表達顯著下降,說明CB處理能提高胚胎的乙�；潭�;多能性基因Oct4在囊胚期,Nanog、Sox2在4細胞至囊胚時期的表達水平顯著高于對照組,進一步證明CB能激活轉(zhuǎn)錄,促進基因的表達;印記基因H19和Igf2的表達量有一定變化,而在CB組和對照組中,H19從GV期到8細胞期以及Igf2在桑椹胚和囊胚期都幾乎不表達,說明CB對孤雌胚胎印記基因的缺陷只有一定的緩解作用,不能改變其表達趨勢。3、本實驗用CB、Scriptaid和5-Aza-Cdr三種藥物組合處理豬孤雌激活的胚胎,研究其對胚胎發(fā)育的影響。實驗分為1個對照組和7個實驗組,7個實驗組分別是:CB、Scriptaid、5-Aza-Cdr、CB+Scriptaid、CB+5-Aza-Cdr、Scriptaid+5-Aza-Cdr和CB+Scriptaid+5-Aza-Cdr。結(jié)果表明,5μg/mL CB能夠補充或者進一步促進Scriptaid、5-Aza-Cdr和Scriptaid+5-Aza-Cdr對胚胎發(fā)育的影響,提高卵裂率或囊胚率并進一步降低凋亡相關(guān)基因的Bcl-xl、Bax和Casp3的表達水平,促進豬孤雌胚胎的發(fā)育。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S828

【參考文獻】

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1 ZHOU Yan;HUANG YongYe;XIE WanHua;SONG Qi;JI Yuan;ZHANG YanPing;OUYANG HongSheng;LAI LiangXue;PANG DaXin;TANG XiaoChun;;Scriptaid affects histone acetylation and the expression of development-related genes at different stages of porcine somatic cell nuclear transfer embryo during early development[J];Chinese Science Bulletin;2013年17期

2 康雅雅;馬紅;任亮;趙誠悅;齊貴龍;柳櫻子;劉娣;;曲古抑菌素A和5-氮雜-2'-脫氧胞苷對豬孤雌胚胎發(fā)育的影響[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2013年07期

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本文編號：1209340