本文關鍵詞：家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP141的表達特征及對饑餓的響應

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【摘要】：【目的】分析家蠶(Bombyx mori)絲氨酸蛋白酶基因BmSP141序列信息,明確其時空表達模式,結合饑餓與重新喂食處理對其表達的影響,探究該基因在家蠶中的功能。【方法】對家蠶絲氨酸蛋白酶基因BmSP141進行T-A克隆,得到其編碼區(qū)核苷酸序列;應用生物信息學在線網(wǎng)站對該基因編碼區(qū)推導的氨基酸序列、分子量、結構域等信息進行分析;利用Clustal X1.8和MEGA5.02軟件對BmSP141與其他物種的絲氨酸蛋白酶進行多序列比對和系統(tǒng)發(fā)生樹分析;構建原核表達載體p28-BmSP141,并轉化到Rosetta(DE3)菌株中誘導表達,利用鎳柱親和層析純化重組蛋白。利用半定量RT-PCR和實時熒光定量PCR方法對其組織和時期表達特征進行分析;采用蛋白質免疫印跡(Western blot)技術,分別分析BmSP141蛋白在家蠶5齡第3天各組織的表達情況和5齡幼蟲中腸的表達變化;通過免疫熒光定位分析BmSP141蛋白在4齡幼蟲中腸的分布情況;利用實時熒光定量PCR和Western blot方法對饑餓處理和再喂食后BmSP141的表達情況進行分析�！窘Y果】BmSP141編碼含有292個氨基酸的蛋白,其中第1—17位氨基酸為信號肽,其成熟體蛋白預測分子量為25.9 k D,等電點為7.8。同源序列比對表明,BmSP141與煙芽夜蛾絲氨酸蛋白酶和蓓帶夜蛾絲氨酸蛋白酶序列同源性較高,分別達到62%和63%。這些同源序列具有保守的催化三聯(lián)體,與活性相關的基序也很保守,但與胰凝乳蛋白酶保守的底物特異性位點相比,BmSP141的底物特異性位點發(fā)生改變。在16和37℃條件下誘導后,重組蛋白均以包涵體形式表達,經(jīng)鎳柱親和層析純化后得到了較純的重組蛋白,并用該蛋白制備了效價較高的多克隆抗體。組織和時期表達特征分析表明,該基因主要在家蠶幼蟲的中腸組織特異性表達,且在幼蟲起蠶到食桑期表達逐漸增加,但眠期表達下降,蛹期和成蟲期表達水平較低。Western blot分析也表明,BmSP141蛋白僅在家蠶中腸組織表達,且從5齡起蠶到上蔟表達量先增加后降低。免疫熒光定位結果表明,BmSP141定位于中腸上皮細胞的細胞質中,進一步證實BmSP141在中腸特異表達。在轉錄和翻譯水平,BmSP141饑餓處理后表達量顯著下調,而重新喂食后其表達量上調,表明BmSP141的表達受到消化道食物的誘導�！窘Y論】家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP141在中腸組織表達,在幼蟲期食桑期高表達,蛹期和成蟲期表達水平較低,受消化道食物的誘導而上調表達,推測該基因可能參與家蠶中腸的消化過程。
【作者單位】： 西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室;陜西理工學院維生素D生理與應用研究所;
【基金】：國家自然科學基金(31472154) 西南大學博士基金(swu115024)
【分類號】：S811.2;Q78
【正文快照】： 0引言【研究意義】絲氨酸蛋白酶(serine protease,SP)是一類以絲氨酸為活性中心的重要蛋白水解酶,其主要作用是斷裂大分子蛋白質中的肽鍵,使之成為小分子蛋白質。對昆蟲而言,絲氨酸蛋白酶對其消化、發(fā)育、蛻皮、變態(tài)等生理過程尤其重要[1-4]。絲氨酸蛋白酶家族是鱗翅目昆蟲幼

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