本文關(guān)鍵詞：家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP141的表達(dá)特征及對(duì)饑餓的響應(yīng)

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【摘要】：【目的】分析家蠶(Bombyx mori)絲氨酸蛋白酶基因BmSP141序列信息,明確其時(shí)空表達(dá)模式,結(jié)合饑餓與重新喂食處理對(duì)其表達(dá)的影響,探究該基因在家蠶中的功能�！痉椒ā繉�(duì)家蠶絲氨酸蛋白酶基因BmSP141進(jìn)行T-A克隆,得到其編碼區(qū)核苷酸序列;應(yīng)用生物信息學(xué)在線網(wǎng)站對(duì)該基因編碼區(qū)推導(dǎo)的氨基酸序列、分子量、結(jié)構(gòu)域等信息進(jìn)行分析;利用Clustal X1.8和MEGA5.02軟件對(duì)BmSP141與其他物種的絲氨酸蛋白酶進(jìn)行多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析;構(gòu)建原核表達(dá)載體p28-BmSP141,并轉(zhuǎn)化到Rosetta(DE3)菌株中誘導(dǎo)表達(dá),利用鎳柱親和層析純化重組蛋白。利用半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)其組織和時(shí)期表達(dá)特征進(jìn)行分析;采用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)技術(shù),分別分析BmSP141蛋白在家蠶5齡第3天各組織的表達(dá)情況和5齡幼蟲中腸的表達(dá)變化;通過(guò)免疫熒光定位分析BmSP141蛋白在4齡幼蟲中腸的分布情況;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot方法對(duì)饑餓處理和再喂食后BmSP141的表達(dá)情況進(jìn)行分析�！窘Y(jié)果】BmSP141編碼含有292個(gè)氨基酸的蛋白,其中第1—17位氨基酸為信號(hào)肽,其成熟體蛋白預(yù)測(cè)分子量為25.9 k D,等電點(diǎn)為7.8。同源序列比對(duì)表明,BmSP141與煙芽夜蛾絲氨酸蛋白酶和蓓帶夜蛾絲氨酸蛋白酶序列同源性較高,分別達(dá)到62%和63%。這些同源序列具有保守的催化三聯(lián)體,與活性相關(guān)的基序也很保守,但與胰凝乳蛋白酶保守的底物特異性位點(diǎn)相比,BmSP141的底物特異性位點(diǎn)發(fā)生改變。在16和37℃條件下誘導(dǎo)后,重組蛋白均以包涵體形式表達(dá),經(jīng)鎳柱親和層析純化后得到了較純的重組蛋白,并用該蛋白制備了效價(jià)較高的多克隆抗體。組織和時(shí)期表達(dá)特征分析表明,該基因主要在家蠶幼蟲的中腸組織特異性表達(dá),且在幼蟲起蠶到食桑期表達(dá)逐漸增加,但眠期表達(dá)下降,蛹期和成蟲期表達(dá)水平較低。Western blot分析也表明,BmSP141蛋白僅在家蠶中腸組織表達(dá),且從5齡起蠶到上蔟表達(dá)量先增加后降低。免疫熒光定位結(jié)果表明,BmSP141定位于中腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,進(jìn)一步證實(shí)BmSP141在中腸特異表達(dá)。在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,BmSP141饑餓處理后表達(dá)量顯著下調(diào),而重新喂食后其表達(dá)量上調(diào),表明BmSP141的表達(dá)受到消化道食物的誘導(dǎo)�！窘Y(jié)論】家蠶絲氨酸蛋白酶BmSP141在中腸組織表達(dá),在幼蟲期食桑期高表達(dá),蛹期和成蟲期表達(dá)水平較低,受消化道食物的誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá),推測(cè)該基因可能參與家蠶中腸的消化過(guò)程。
【作者單位】： 西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;陜西理工學(xué)院維生素D生理與應(yīng)用研究所;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(31472154) 西南大學(xué)博士基金(swu115024)
【分類號(hào)】：S811.2;Q78
【正文快照】： 0引言【研究意義】絲氨酸蛋白酶(serine protease,SP)是一類以絲氨酸為活性中心的重要蛋白水解酶,其主要作用是斷裂大分子蛋白質(zhì)中的肽鍵,使之成為小分子蛋白質(zhì)。對(duì)昆蟲而言,絲氨酸蛋白酶對(duì)其消化、發(fā)育、蛻皮、變態(tài)等生理過(guò)程尤其重要[1-4]。絲氨酸蛋白酶家族是鱗翅目昆蟲幼

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本文編號(hào)：1193069