本文關(guān)鍵詞：鴨瘟病毒單抗的制備及膠體金試紙條檢測方法的建立

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【摘要】：【目的】鴨瘟(DP)是由鴨瘟病毒(DPV)引起的一種急性、敗血性傳染病,以頭頸腫脹、食道黏膜和泄殖腔黏膜出血、黃白色潰瘍,頭頸部皮下有黃白色膠凍樣滲出為特征。該病一旦發(fā)生,發(fā)病急、死亡快、死亡率高,對養(yǎng)鴨業(yè)危害嚴重�？焖僭\斷是控制鴨瘟的重要措施之一,可以及時確定病原,以便采取有效的防制手段。試驗旨在建立鴨瘟病毒(DPV)膠體金快速檢測方法。【方法】利用生物學(xué)軟件Protean分析,選擇鴨瘟病毒抗原表位較多的一段序列設(shè)計引物,PCR擴增目的基因。連接到載體pMD-18T上,測序正確后再連接到原核表達載體pET-28a上。將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta感受態(tài)細胞中進行誘導(dǎo)表達。表達的蛋白經(jīng)純化后測其濃度并經(jīng)Western blotting鑒定分析。以表達的DPV-gB蛋白作為抗原,免疫7周齡BALB/c小鼠,取其脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合,經(jīng)間接ELISA篩選及亞克隆,獲得DPV-gB特異性單克隆抗體。采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒,以制備的H6F6單抗作為標記抗體(標記的最適pH為8.0—8.5,最佳標記濃度為15倍原液稀釋),將純化的A8D7單抗(濃度為2倍原液稀釋)和羊抗鼠IgG(濃度為10倍稀釋)包被在硝酸纖維素膜(NC)上,分別作為檢測線和質(zhì)控線,經(jīng)條件優(yōu)化建立了鴨瘟病毒膠體金試紙條檢測方法�！窘Y(jié)果】共獲得4株能穩(wěn)定分泌抗DPV-gB蛋白抗體的雜交瘤細胞株,命名為A8D7、E6C3、H11F8、H6F6。間接ELISA檢測腹水效價分別為1:10~3、1:10~3、1:10~5、1:10~3。亞類鑒定結(jié)果分別為IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1,輕鏈均為kappa鏈。Western blotting結(jié)果顯示4株單抗均能與DPV-gB蛋白特異性結(jié)合。IFA結(jié)果顯示制備的4株單抗是針對DPV產(chǎn)生的。建立的膠體金試紙條方法能夠特異性地檢測鴨瘟病毒,與鴨坦布蘇病毒、H9N2亞型禽流感病毒、呼腸孤病毒、減蛋綜合征病毒無反應(yīng)。陽性尿囊液稀釋50倍后用該試紙條檢測依然為陽性;用不同批次的試紙條重復(fù)檢測,結(jié)果無差異。利用制備的膠體金試紙條和PCR方法對38份臨床樣品進行檢測比較,結(jié)果顯示兩者符合率為91.6%。【結(jié)論】本研究建立的試紙條檢測方法具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性,可用于DPV的快速檢測。
【作者單位】： 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院;
【基金】：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-43-10)
【分類號】：S858.32
【正文快照】：

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 孫建慧;黃立平;危艷武;吳洪麗;王一平;張輝;劉丹;陳冬杰;張智慧;劉長明;;豬細小病毒1型VP2蛋白的表達與單克隆抗體的制備及應(yīng)用[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2014年12期

2 孫園園;王云龍;李玉林;王繼創(chuàng);程蕾;鄧黎黎;;pH值對膠體金標記單克隆抗體性能的影響[J];細胞與分子免疫學(xué)雜志;2014年11期

3 李向梅;王戰(zhàn)輝;肖希龍;王照鵬;溫凱;吳小平;夏曦;武晉孝;江海洋;;同時檢測牛奶中喹諾酮類和慶大霉素殘留的膠體金免疫層析方法研究[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年19期

4 宋萬杰;胡伯里;金玉蘭;阮系真;邵敬霞;周繼勇;;豬圓環(huán)病毒2型抗體膠體金免疫層析方法的建立[J];中國獸醫(yī)科學(xué);2014年07期

5 張鑫宇;左偉勇;朱善元;夏曉莉;孫懷昌;;非洲豬瘟病毒p54抗體膠體金試紙檢測方法的建立[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2014年04期

6 顧菲菲;高海崗;陸建榮;;不同粒徑大小膠體金的制備[J];中國畜牧獸醫(yī)文摘;2013年10期

7 吳曉平;吳異健;韓典霖;吳寶成;黃一帆;;原核表達番鴨呼腸孤病毒σC與σB蛋白對雛番鴨的免疫保護[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年14期

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本文編號：1173829