本文關(guān)鍵詞：雞白痢沙門菌SseL效應蛋白生物學特性的初步研究

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【摘要】：沙門菌是一種兼性胞內(nèi)寄生的革蘭陰性病原菌,目前已鑒定出2,600多種血清型,其中,雞白痢沙門菌(Salmonella enterica serovar Pullorum, Salmonella Pullorum)作為宿主專嗜性致病菌,主要侵害20日齡以內(nèi)的雛雞,發(fā)病表現(xiàn)為急性的敗血經(jīng)過,以發(fā)熱、拉白色粥樣或黏性糞便為特征,具有高致病性和高死亡率。成年雞感染雞白痢沙門菌后多成為隱性的、無癥狀的帶菌雞,且該病原菌可經(jīng)卵巢垂直傳播。雞白痢沙門菌在西方一些發(fā)達國家已基本被清除,但在包括我國在內(nèi)的發(fā)展中國家仍然流行,給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。因此,對雞白痢致病機制的探究有助于研究出安全、有效的雞白痢防治措施,在降低雞白痢發(fā)病率、提高雛雞成活率等方面都具有十分重要的意義。沙門菌對宿主細胞的侵襲能力及其胞內(nèi)存活、增殖能力與沙門菌致病島(Salmonella pathogenicity island, SPI)相關(guān),其中SPI-1, SPI-2編碼的III型分泌系統(tǒng)(type III secretion system, T3SS)通過分泌相關(guān)效應蛋白來干擾宿主細胞正常的免疫應答,是沙門菌細胞內(nèi)存活以及致病的關(guān)鍵因素之一。目前對SPI編碼的T3SS的研究主要以腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌感染哺乳動物為模型,而在其它沙門菌感染模型中研究較少。鑒于雞白痢沙門菌的特殊性(如宿主專嗜性,無鞭毛等),其T3SS效應蛋白值得研究,但未深入開展。本研究成功構(gòu)建了雞白痢沙門菌S06004 sseL基因缺失株、回復株以及真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-SseL-flag,對雞白痢沙門菌S06004 SseL效應蛋白毒力調(diào)節(jié)作用及抑制細胞NF-κB炎性通路進行了初步的研究。1.雞白痢沙門菌S06004 sseL基因缺失株的構(gòu)建及其毒力評價本研究利用γ-Red同源重組系統(tǒng)對雞白痢沙門菌S06004 sseL基因進行了敲除,成功構(gòu)建了雞白痢沙門菌缺失株S06004AsseL;并通過重組子成功構(gòu)建回復株S06004ΔsseL::sseL。PCR試驗與測序結(jié)果表明,S06004ΔsseL的sseL基因被成功敲除。與野生株S06004相比,sseL基因缺失株、回復株的生長、生化特性沒有顯著差異。對沙門菌菌株進行毒力評價,結(jié)果顯示,S06004ΔsseL的LD50(約為8.79×108 CFU)較野生株S06004的LD50(約為1.62×107 CFU)升高了約60倍,而回復株LD50(1.76×108)僅升高了約10倍,說明回復株毒力有所回復。與野生株相比,sseL基因缺失株、回復株對禽巨噬細胞HD-11的黏附、侵襲率沒有顯著差異,但缺失株在細胞內(nèi)的增殖能力顯著降低,在增殖過程的4個時間點(0,2,5,10 h)中,5h和10 h的增殖倍數(shù)明顯低于(約2倍)野生株(P0.05),而回復株的增殖能力有所回復。雞白痢沙門菌感染細胞后,通過HD-11活細胞計數(shù)比較顯示,缺失株感染后10h的活細胞比率為69.3%,明顯高于野生株感染后10h的活細胞比率(40.6%)(P0.05)。此外,體內(nèi)外競爭生長實驗結(jié)果顯示,缺失株和野生株的體外競爭生長指數(shù)為0.42±0.05；感染海蘭白雛雞后3d和5d,脾臟內(nèi)競爭生長指數(shù)分別0.24±0.03和0.46±0.012,肝臟中競爭生長指數(shù)分別為0.25±0.02和0.57±0.046(P0.05)。因此,sseL基因缺失株與野生株體外競爭生長能力差別不顯著,而體內(nèi)競爭生長能力在3d時顯著弱于野生株,5d時差別不顯著。2.雞白痢沙門菌效應蛋白SseL抑制細胞NF-κB炎性通路初步研究野生株與缺失株分別感染HD-11細胞,感染后8h提取細胞總RNA,熒光定量PCR檢測相關(guān)細胞因子IL-1β, IL-4, IL-6, IFN-γ, CXCLi2, CCLi2, NKAP, TANK, MUL1, NKIRA的mRNA表達量。結(jié)果顯示,與野生株感染組相比,缺失株感染組炎性細胞因子IL-4, IFN-γ, CXCLi2, CCLi2的表達明顯上調(diào)(P0.05),且NF-κB相關(guān)細胞因子NKAP, TANK的表達也有明顯上調(diào)(P0.05)。本研究成功構(gòu)建了雞白痢沙門菌真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-SseL(S06004)-flag與鼠傷寒沙門菌真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-SseL(SL1344)-flag。真核表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞后,收集細胞裂解液進行Western-blot分析,檢測到37 kDa左右的目的蛋白,表明SseL在HEK293細胞中得到表達。將真核表達質(zhì)粒、pCMV-TRL4、pCMV-MD2、NF-κB熒光素酶報告基因共轉(zhuǎn)染HEK293細胞,LPS刺激后,檢測SseL的表達對NF-κB炎性通路的影響,結(jié)果表明雞白痢沙門菌與鼠傷寒沙門菌效應蛋白SseL的表達都能夠抑制NF-κB炎性通路的激活,與陰性對照組相比抑制效果達2-3倍(P0.05),且雞白痢沙門菌效應蛋白SseL抑制NF-κB炎性信號通路的程度,與鼠傷寒沙門菌效應蛋白SseL相比,沒有明顯差異。綜上所述,雞白痢沙門菌T3SS2效應蛋白SseL編碼基因sseL是一個重要的毒力基因,且SseL作為一種去泛素化酶能夠靶作用于細胞NF-κB信號途徑,抑制NF-κB信號通路的激活,進而發(fā)揮抑制炎性反應的作用。
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61

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