本文關(guān)鍵詞：歐洲型PRRSV重組腺病毒疫苗構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)免疫研究

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【摘要】：我國于1995年底首次報(bào)道豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征(Procine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS),該病自發(fā)現(xiàn)至今已成為影響?zhàn)B豬業(yè)的主要疾病之一,引起該病的病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Procine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)。一直以來我國流行的主要是美洲型PRRSV及其變異株,然而近年來相繼在國內(nèi)有歐洲型PRRSV分離株的報(bào)道。歐洲型PRRSV于上世紀(jì)九十年代初對歐洲養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失,國內(nèi)尚無應(yīng)對該病的有效疫苗及預(yù)防措施,國內(nèi)歐洲型PRRSV的發(fā)現(xiàn)對PRRSV的防治提出了新的挑戰(zhàn)。本研究以缺失型腺病毒為載體,構(gòu)建表達(dá)歐洲型PRRSV LV株ORF3、ORF5目的基因的重組腺病毒,將所構(gòu)建的重組腺病毒進(jìn)行小鼠免疫試驗(yàn)及豬免疫試驗(yàn),并對重組腺病毒疫苗的免疫效果進(jìn)行分析。先以PRRSV LV株ORF3、ORF5及豬IL-18為目的基因構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pacad-EU-ORF3、pacad-EU-ORF5、pacad-EU-ORF3-ORF5、pacad-IL-18及pacad-EU-ORF3-ORF5-IL-18。然后將所構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒pacad59.2-100以Pac I限制性內(nèi)切酶線性化,共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞,包裝重組腺病毒rAd-EU-ORF3、rAd-EU-ORF5、rAd-EU-ORF3-ORF5、rAd-IL-18及rAd-EU-ORF3-ORF5-IL-18。用蛋白免疫印跡(Western Blot)及間接免疫熒光(Indirect Immunofluorescence Assay,IFA)等方法對包裝獲得的重組腺病毒進(jìn)行驗(yàn)證鑒定,結(jié)果均顯示出重組腺病毒可表達(dá)GP3及GP5目的蛋白。不同目的基因之間以自裂解Linker連接,為驗(yàn)證自裂解Linker是否有裂解功能及裂解效率,包裝重組腺病毒rAd-EU-ORF3-ORF5-EGFP。并將接種rAd-EU-ORF3-ORF5-EGFP的細(xì)胞于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察,可見重組腺病毒可高效表達(dá)綠色熒光基因(EGFP)。將所構(gòu)建的重組腺病毒疫苗進(jìn)行小鼠免疫試驗(yàn),結(jié)果顯示:重組腺病毒疫苗可顯著提高小鼠體液免疫及細(xì)胞免疫水平,其中共表達(dá)GP3和GP5基因的免疫組小鼠特異性抗體水平要高于單獨(dú)免疫的rAd-EU-ORF3及rAd-EU-ORF5組。35d時,特異性抗體水平最高的rAd-EU-ORF3-ORF5-IL-18是單獨(dú)免疫的rAd-EU-ORF3及rAd-EU-ORF5組的1.29倍與1.10倍(P0.05)。中和抗體檢測顯示免疫35d時免疫組rAd-EU-ORF3-ORF5-IL-18中和抗體水平最高,中和抗體滴度在1:16以上(P0.05)。免疫后35d小鼠T淋巴細(xì)胞增殖水平顯著高于14d淋巴細(xì)胞增殖水平,淋巴細(xì)胞亞群檢測顯示免疫rAd-EU-ORF3-ORF5組CD4+及CD8+水平為野毒組的2.3倍和1.4倍,免疫組rAd-EU-ORF3-ORF5-IL-18組CD4+及CD8+水平為野毒組的1.6倍和1.5倍,表明重組腺病毒疫苗可促進(jìn)CD3+CD4+、CD3+CD8+淋巴細(xì)胞增殖。對重組腺病毒疫苗的殘留檢測顯示重組腺病毒疫苗可在小鼠體內(nèi)存留14d之久,表明重組腺病毒疫苗可對小鼠提供較長時間的免疫刺激。在小鼠免疫試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,將所構(gòu)建的重組腺病毒疫苗進(jìn)行豬免疫試驗(yàn),免疫結(jié)果顯示:各試驗(yàn)組抗體水平均有所提高,其中免疫rAd-EU-ORF3-ORF5-IL-18+Quil A免疫效果最好,GP3及GP5特異性抗體是不加佐劑組rAd-EU-ORF3-ORF5-IL-18的1.13倍和1.15倍(P0.05)。中和抗體檢測顯示多數(shù)組別的中和抗體滴度均達(dá)到1:16以上(P0.05)。淋巴細(xì)胞增殖及T淋巴細(xì)胞亞群檢測顯示顯示重組腺病毒疫苗可有效刺激淋巴細(xì)胞增殖,CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞與野毒組相比差異顯著(P0.05),表明當(dāng)PRRSV再次侵入機(jī)體時,機(jī)體的T淋巴細(xì)胞可迅速增殖,發(fā)揮細(xì)胞免疫應(yīng)答功能。對免疫動物攻毒保護(hù)試驗(yàn)也顯示重組腺病毒疫苗可有效降低血液及組織中病毒載量,其中免疫rAd-EU-ORF3-ORF5-IL-18及rAd-EU-ORF3-ORF5-IL-18+Quil A組臟器的病毒載量為野毒組5%-10%,表明重組腺病毒可有效減少感染豬病毒血癥的發(fā)生。綜合分析,重組腺病毒疫苗可誘導(dǎo)小鼠及豬產(chǎn)生體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答,并對免疫動物提供較好的保護(hù)作用。通過對重組腺病毒疫苗的研究,為歐洲型PRRSV疫苗的進(jìn)一步研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4

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本文編號：1151028