本文關(guān)鍵詞：PRRSV的分離鑒定和VLPs的構(gòu)建

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【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗稱藍(lán)耳病,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種接觸性傳染病,主要引起母豬流產(chǎn)及仔豬呼吸系統(tǒng)障礙,其高發(fā)病率和致死率給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。目前防控PRRS的措施除了嚴(yán)格的生物安全措施外,最有效的辦法就是疫苗接種。臨床上主要采用滅活疫苗和弱毒疫苗預(yù)防免疫,但其存在免疫效果差和返毒等缺陷,使得人們的目光不得不轉(zhuǎn)向其他新型疫苗的研制以控制PRRS的發(fā)生和流行。本研究通過對PRRSV重慶株的分離鑒定,選取其GP5和M基因,構(gòu)建PRRS病毒樣顆粒(Virus-like Particles,VLPs),在小鼠體內(nèi)進(jìn)行免疫活性的評估,為研制PRRS的新型疫苗奠定基礎(chǔ)。1重慶株P(guān)RRSV的分離鑒定從重慶某豬場采集病死豬病料,經(jīng)RT-PCR初步鑒定其病原為PRRSV后,利用反轉(zhuǎn)錄合成c DNA,設(shè)計(jì)NSP2和GP5基因片段的特異性引物,并對其擴(kuò)增,序列測序,分析鑒定。結(jié)果表明,該分離株的NSP2基因與經(jīng)典毒株VR-2332核苷酸同源性僅為66.7%,與高致病變異株SD、JXA1的核苷酸同源性高達(dá)98.8%,GP5基因在個(gè)別堿基上也存在變異,由此表明該毒株為高致病性(High Pathogenicity,HP)PRRSV變異株。同時(shí)將該病料接種于Marc-145細(xì)胞,可觀察到典型的細(xì)胞病變(cytopathic effect,CPE),經(jīng)Reed-Muench計(jì)算該分離株的病毒滴度為10-5.67 TCID50/0.1 m L。2 PRRSV-VLPs的構(gòu)建為構(gòu)建HP-PRRSV病毒樣顆粒(VLPs)疫苗,本研究以分離鑒定的HP-RRSV重慶株(CQ)的GP5和M全部編碼基因?yàn)槟０?利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),共表達(dá)GP5和M蛋白,并采用SDS-PAGE、Western blotting對重組蛋白進(jìn)行定性分析;蔗糖梯度離心進(jìn)行純化;通過電子透射顯微鏡對VLPs進(jìn)行直觀的形態(tài)學(xué)鑒定。結(jié)果表明:利用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能夠成功的共表達(dá)GP5和M蛋白,并能自動(dòng)裝配成VLPs,并顯示具有與天然蛋白類似的免疫原性;電鏡觀察到VLPs的形態(tài)與文獻(xiàn)中描述一致,直徑約50 nm。3 PRRSV-VLPs免疫活性測定BALB/c小鼠肌肉三次注射不同劑量(5.0,10.0,20.0,50.0,100.0μg)的PRRSV-VLPs疫苗,用商用的滅活疫苗做陽性對照,無菌的生理鹽水做陰性對照。結(jié)果顯示陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組GP5抗體滴度顯著高于陰性對照;在免疫劑量50.0、100.0μg PRRSV-VLPs的小鼠血清中檢測到中和抗體;實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組都檢測到細(xì)胞因子水平,其中,免疫20.0μg PRRSV-VLPs小鼠的IL-4水平顯著高于其他組;免疫50.0μg PRRSV-VLPs小鼠的IFN-γ水平顯著高于其他組;整體規(guī)律不明顯。這些數(shù)據(jù)表明PRRSV-VLPs能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的細(xì)胞免疫和體液免疫,是預(yù)防PRRS的一種潛在候選疫苗。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：1148197