本文關(guān)鍵詞：shRNA抑制豬傳染性胃腸炎病毒在PK-15細胞中增殖的研究

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【摘要】：豬傳染性胃腸炎(Porcine transmissible gastroenteritis,TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起豬的一種急性、高度接觸性傳染病,以脫水、腹瀉和嘔吐為臨床癥狀。任何年齡和品種的豬都可感染,尤其是2周齡以內(nèi)仔豬,給世界各地養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。常規(guī)藥物針對TGE沒有明顯的治療效果,雖然通過疫苗接種和屠宰感染豬在一定程度上能控制TGE的流行,但免疫失敗時有發(fā)生。因此有必要探索新的抗病毒方法來對該病進行防控。RNA干擾是一種由雙鏈小RNA介導(dǎo)的以序列特異性方式誘導(dǎo)同源m RNA降解的基因沉默機制。由于RNAi技術(shù)能夠特異性阻斷特定基因的表達,所以該技術(shù)被認為是抗病毒感染的最有效方法之一。TGEV屬冠狀病毒科冠狀病毒屬、基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA,長約2.86×104bp,主要包括4種結(jié)構(gòu)蛋白。M基因在TGEV形態(tài)發(fā)生過程中具有關(guān)鍵作用,本文根據(jù)TGEV M基因的結(jié)構(gòu)序列和短發(fā)卡RNA(shRNA)序列設(shè)計原則,設(shè)計并合成了3對shRNA序列,構(gòu)建成RNA干擾載體。將重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染劑的介導(dǎo)下導(dǎo)入豬腎細胞(PK-15),接種TGEV后,分別從病毒感染滴度、基因表達產(chǎn)物和病毒基因組RNA復(fù)制水平三個方面研究特異性shRNA對TGEV在PK-15中增殖的影響。主要結(jié)果如下:1.從TGEV CQ毒株中擴增M基因并獲得核苷酸序列,生物信息學(xué)分析結(jié)果表明不同分離株的M基因高度保守,與南京SHXB株親緣關(guān)系最近,屬于同一分支,M蛋白存在信號肽,剪切位點在16-17位氨基酸之間,存在3個跨膜區(qū),是以β-折疊和β-轉(zhuǎn)角為主的蛋白。2.分別設(shè)計了靶向TGEV CQ株M基因103~121位、358~376位和625~643位m RNA的編碼shRNA的單鏈核苷酸,經(jīng)退火后形成編碼shRNA的雙鏈DNA,將其分別與表達載體pRNAT-U6.1/Neo連接,成功獲得重組干擾質(zhì)粒載體pRNAT-1、pRNAT-2和pRNAT-3。PK-15細胞培養(yǎng)到50-70%融合時,對細胞分別轉(zhuǎn)染不同的干擾質(zhì)粒載體,轉(zhuǎn)染24h后進行熒光觀察確認表達載體成功轉(zhuǎn)入細胞。3.PK-15細胞轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒載體后培養(yǎng)24h,接種1×103 TCID50 TGEV繼續(xù)培養(yǎng)48h后,通過CPE、TCID50、IFA和Real time RT-PCR分析TGEV在PK-15細胞中的增殖情況。CPE分析發(fā)現(xiàn),對照孔在接種TGEV 48h后,大部分細胞出現(xiàn)典型的細胞病變,pRNAT-1細胞的病變程度也較重,相比之下,干擾質(zhì)粒pRNAT-2和pRNAT-3能減輕TGEV在PK-15細胞上引起的特異性病變。IFA和TCID50結(jié)果進一步表明,pRNAT-2和pRNAT-3干擾質(zhì)粒能在蛋白水平上有效抑制病毒的增殖。此外,Real time RT-PCR結(jié)果顯示3個干擾質(zhì)粒pRNAT-1、pRNAT-2和pRNAT-3在m RNA水平上抑制效率分別為13%,68%和70%,表明3個干擾質(zhì)粒在不同程度上能抑制病毒基因組的復(fù)制,其中完全靶向M基因保守結(jié)構(gòu)域的pRNAT-2和pRNAT-3干擾質(zhì)粒抑制效果好于干擾質(zhì)粒pRNAT-1�？傊�,通過RNAi途徑在細胞水平上研究TGEV M基因功能和復(fù)制的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)靶向TGEV M基因358~376位和625~643位的si RNA能在m RNA和蛋白水平有效抑制TGEV的復(fù)制,保護PK-15細胞抵御TGEV CQ株引起的細胞病變。這能為后期篩選特定分子抑制劑提供靶標(biāo)位點以及為新型藥物的研制提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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5 郭錦s，

本文編號：1147744