本文關(guān)鍵詞：在轉(zhuǎn)基因鼠中驗證豬MyoG啟動子驅(qū)動豬PPARγ基因的上調(diào)表達(dá)

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【摘要】：在近幾十年豬育種中,國內(nèi)外的研究一直注重豬瘦肉率的提高而忽略肌肉品質(zhì)。肌肉品質(zhì)一般表現(xiàn)為肉質(zhì)的嫩度、多汁性和口味,肌內(nèi)脂肪的提高能夠使肌肉的嫩度、多汁性得到提高。本實驗室已經(jīng)構(gòu)建了調(diào)節(jié)肌內(nèi)脂肪含量的肌肉特異性表達(dá)載體pGL3-MyoG-PPARγ-Flag-poly(A)Signal,主要包括豬肌肉特異性表達(dá)基因肌細(xì)胞生成素(Myogenin,MyoG)的啟動子和脂肪相關(guān)基因過氧化物酶體增殖激活受體γ(Peroxisome Proliferator-Activated Receptorsγ,PPARγ),質(zhì)粒的活性在C2C12細(xì)胞中得到驗證后進(jìn)行線性化處理,利用原核顯微注射法成功制備MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠。本試驗以轉(zhuǎn)基因鼠為模型,從MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠的表型、DNA水平、mRNA水平、蛋白水平這幾個方面驗證組織特異性啟動子MyoG對MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因小鼠的影響和MyoG啟動子的活性。最終證明肌肉特異性啟動子MyoG可以驅(qū)動外源PPARγ基因在活體水平上調(diào)表達(dá)。主要研究結(jié)果如下:1、分別對4只首建鼠進(jìn)行繁殖、建系。首建♂1鼠得到了穩(wěn)定遺傳的后代,截止目前已傳至F5代。首建♂1轉(zhuǎn)基因小鼠陽性率已達(dá)到95%,達(dá)到建系的標(biāo)準(zhǔn)。2、繪制小鼠1-12周齡的體重增長曲線,以及對3個階段(1月齡、2月齡、3月齡)MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠和FVB野生型鼠血清中與脂肪相關(guān)的部分指標(biāo)檢測,研究結(jié)果表明:每個時間段MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠和FVB野生型鼠在體重增長方面沒有顯著性差異(p0.05);1月齡、2月齡MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠和FVB野生型鼠血清中的總膽固醇和甘油三酯均差異顯著(p0.05)。所檢測的每只鼠的指標(biāo)均在FVB型鼠正常范圍之內(nèi)。這兩項結(jié)果確定外源基因的插入并不影響轉(zhuǎn)基因鼠的健康。3、采用絕對定量PCR的技術(shù),分析MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠拷貝數(shù),結(jié)果表明:首建♂1鼠的拷貝數(shù)是2.24,說明外源基因并不是單拷貝插入。通過對隨機(jī)選擇的F0-F5代轉(zhuǎn)基因陽性鼠拷貝數(shù)的統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)隨著繁殖代數(shù)的增加,MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠后代外源基因拷貝數(shù)大多都增加,也有少部分降低。4、采用qRT-PCR技術(shù),測定1月齡、2月齡、3月齡MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠外源基因PPARγ以及其下游靶基因脂肪酸結(jié)合蛋白基因(Adipocyte Fatty Acid Binding Proteins,A-FABP)、脂蛋白脂肪酶基因(Lipoprotein Lipase,LPL)mRNA水平的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠相對于FVB野生型鼠均有顯著性升高(p0.05)�？v向比較1月齡、2月齡、3月齡MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠外源基因PPARγ的表達(dá)量,1月齡MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠相對于FVB野生型鼠外源基因PPARγ的表達(dá)量提升最多。5、采用Western Blot、免疫組化技術(shù)檢測外源基因PPARγ蛋白水平的變化,結(jié)果顯示,MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠相對于FVB野生型鼠PPARγ蛋白表達(dá)量有所提高。6、檢測1月齡、2月齡、3月齡MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠和FVB野生型鼠進(jìn)行腿肌中甘油三酯含量,發(fā)現(xiàn)整個生長階段MyoG-PPARγ轉(zhuǎn)基因鼠甘油三酯的表達(dá)量都顯著高于FVB野生型鼠(p0.05)。隨著小鼠的生長發(fā)育,小鼠脂肪沉積逐漸增加。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S828

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