本文關(guān)鍵詞：雞傳染性喉氣管炎病毒單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立

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【摘要】：傳染性喉氣管炎(Infectious Laryngotracheitis, ILT)是由傳染性喉氣管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus, ILTV)引起雞的一種呼吸道疾病,具有高度的傳染性,在世界各地均有流行。該病可引起病雞呼吸困難、咳出血樣分泌物,產(chǎn)蛋率下降甚至死亡。研制簡便、快速、準(zhǔn)確的診斷方法對ILT的防治至關(guān)重要。本研究制備了抗ILTV gB、gD蛋白的單克隆抗體,建立了ILTV雙抗體夾心ELISA抗原檢測方法,為ILT的快速檢測和診斷提供了一種有效的手段。首先利用原核表達(dá)的IL TV gB、gD蛋白為抗原分別免疫6-8周齡的BALB/c小鼠,取血清抗體效價(jià)大于104的免疫小鼠脾臟制備的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合；利用間接ELISA方法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的篩選及亞克隆,最終獲得能穩(wěn)定分泌抗ILTV gB和gD蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株各2株,分別命名為5A8、1C1、4D6和7D9。制備腹水后,用protein G層析柱純化腹水；利用間接ELISA方法對純化后的腹水進(jìn)行抗體效價(jià)測定,4株雜交瘤細(xì)胞誘生的腹水效價(jià)都大于1：105；Western Blot試驗(yàn)結(jié)果表明,4株單抗都能與其相應(yīng)的蛋白特異性識別；間接免疫熒光試驗(yàn)檢測結(jié)果表明,4株單抗均可與感染ILTV的LMH細(xì)胞產(chǎn)生特異性熒光反應(yīng)。然后,進(jìn)一步利用交叉配對法對單抗及酶標(biāo)單抗進(jìn)行試驗(yàn),最終確定以ILTV單克隆抗體7D9作為包被抗體,以酶標(biāo)抗體7D9-HRP作為檢測抗體,建立了ILTV雙抗體夾心ELISA抗原檢測方法。試驗(yàn)反應(yīng)條件優(yōu)化為：單克隆抗體包被濃度為5μg/mL, 4℃包被過夜;用1%BSA封閉液封閉,37℃孵育120 min；待檢抗原37℃孵育60 mmin;酶標(biāo)抗體工作濃度為2.5μg/mL,37℃孵育60 min。該方法與禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)均無交叉反應(yīng),檢測ILTV最低病毒量為102TCID50/mL,該方法在批次內(nèi)、批間內(nèi)的變異系數(shù)均小于8%。用建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法與PCR方法同時(shí)對40份臨床樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示該方法與PCR的符合率為89.2%,說明本研究雙抗體夾心ELISA抗原檢測方法的特異性、敏感性及重復(fù)性均較好,為ILT的流行病學(xué)調(diào)查及診斷提供了幫助。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31

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本文編號：1140451