本文關(guān)鍵詞：表達(dá)雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)AMA1蛋白的乳酸乳球菌免疫保護(hù)作用

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【摘要】：雞球蟲(chóng)病是由寄生于雞腸道的艾美耳球蟲(chóng)引起的一種嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)發(fā)展的原蟲(chóng)病。雞球蟲(chóng)病給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)龐大的經(jīng)濟(jì)損失�，F(xiàn)階段,雞球蟲(chóng)病的防治主要依靠化學(xué)藥物,由于抗藥性、藥物殘留以及新藥物開(kāi)發(fā)費(fèi)用巨大等一系列問(wèn)題,因此探索出安全、穩(wěn)定、有效的替代方法來(lái)防治雞的球蟲(chóng)病已勢(shì)在必行。球蟲(chóng)子孢子主要是通過(guò)自身分泌蛋白進(jìn)行識(shí)別和黏附,進(jìn)而入侵雞的腸道黏膜細(xì)胞。乳酸乳球菌可以作為疫苗的遞送載體,其表達(dá)的目的蛋白和子孢子入侵前分泌的表面蛋白相似,也同樣可激發(fā)有效保護(hù)性免疫應(yīng)答。選擇乳酸乳球菌作為黏膜免疫方面的活載體疫苗已成為目前研究的熱點(diǎn)之一。頂復(fù)門(mén)寄生原蟲(chóng)的頂膜抗原(AMA1)在蟲(chóng)體入侵宿主細(xì)胞過(guò)程中具有重要作用,但關(guān)于雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(E.tenella)子孢子頂膜抗原(Et AMA1)的功能報(bào)道較少。本研究探索了表達(dá)Et AMA1的重組乳酸乳球菌抗球蟲(chóng)感染的免疫保護(hù)作用。研究首先將Et AMA1胞外域基因片段(Ecto AMA1)克隆入原核表達(dá)載體p ET-30a(+)中構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET30(a)-EctoAMA1。將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中篩選陽(yáng)性菌,陽(yáng)性菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后采用SDS-PAGE和Western blot方法檢測(cè)目的蛋白表達(dá)。使用表達(dá)的蛋白對(duì)新西蘭白兔進(jìn)行免疫以制備多克隆抗體。應(yīng)用間接ELISA方法檢測(cè)制備的抗體效價(jià),并采用Western blot方法檢測(cè)多抗的反應(yīng)性。結(jié)果表明,Ecto AMA1基因全長(zhǎng)為1269bp,SDS-PAGE和Western blot分析顯示,Ecto AMA1在大腸桿菌中以不溶性包涵體的形式進(jìn)行表達(dá),其表達(dá)的重組蛋白的分了量約為52 k Da。多克隆抗體檢測(cè)效價(jià)達(dá)到218,Western blot結(jié)果顯示制備的兔抗AMA1多抗能與子孢子反應(yīng)。之后將Ecto AMA1基因克隆入乳酸菌表達(dá)載體p TX8048中,構(gòu)建三種重組陽(yáng)性質(zhì)粒,即p TX8048-Ecto AMA1、p TX8048-SP-Ecto AMA1和p TX8048-SP-Ecto AMA1-CWA。將鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入宿主菌L.lactis NZ9000中篩選到可胞內(nèi)、分泌和表面表達(dá)目的蛋白三種陽(yáng)性菌L.lactis NZ9000/p TX8048-Ecto AMA1、L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1、L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1-CWA。使用終濃度為5 ng/mL的Nisin誘導(dǎo)重組菌后,Western blot方法檢測(cè)到Ecto AMA1蛋白可以三種方式在宿主菌內(nèi)表達(dá)。將誘導(dǎo)后5 109 CFU L.lactis NZ9000/p TX8048-Ecto AMA1、L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1、L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1-CWA分別于4~6、17~19、31~33日齡三次口服免疫SPF雛雞。43日齡除PBS組外其他各組分別采取口服方式接種4×104個(gè)E.tenella孢子化卵囊。檢測(cè)各組雛雞外周血和脾臟中淋巴細(xì)胞的增殖功能變化、外周血中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化,血清抗體Ig G變化、增重變化、盲腸病變計(jì)分、OPG及ACI等評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果顯示,L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1-CWA組免疫保護(hù)效果最好,L.lactis NZ9000/p TX8048-Ecto AMA1組稍?xún)?yōu)于L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1組,三個(gè)免疫組各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于相應(yīng)對(duì)照組;各免疫組淋巴細(xì)胞增殖活性均顯著高于對(duì)照組;流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,各免疫組外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞型數(shù)量均高于對(duì)照組;ELISA方法檢測(cè)血清Ig G結(jié)果顯示,三種重組菌免疫組抗AMA1血清抗體效價(jià)三次免疫后持續(xù)升高,42日齡時(shí)達(dá)到最高值,對(duì)照組未見(jiàn)升高;L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1-CWA組、L.lactis NZ9000/p TX8048-Ecto AMA1組和L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1組綜合抗球蟲(chóng)指數(shù)值分別為162.50、155.19和152.45。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,以乳酸乳球菌為活疫苗載體經(jīng)口服免疫后可以刺激宿主產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答,對(duì)抗同源感染可起到一定的保護(hù)作用。研究將為基于Et AMA1的雞球蟲(chóng)病乳酸菌口服疫苗研制提供重要參考。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S858.31
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本文編號(hào)：1138943