發(fā)布時間：2017-11-04 10:07

  本文關(guān)鍵詞：表達(dá)雞柔嫩艾美耳球蟲AMA1蛋白的乳酸乳球菌免疫保護(hù)作用

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【摘要】：雞球蟲病是由寄生于雞腸道的艾美耳球蟲引起的一種嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)發(fā)展的原蟲病。雞球蟲病給養(yǎng)禽業(yè)帶來龐大的經(jīng)濟(jì)損失�，F(xiàn)階段,雞球蟲病的防治主要依靠化學(xué)藥物,由于抗藥性、藥物殘留以及新藥物開發(fā)費(fèi)用巨大等一系列問題,因此探索出安全、穩(wěn)定、有效的替代方法來防治雞的球蟲病已勢在必行。球蟲子孢子主要是通過自身分泌蛋白進(jìn)行識別和黏附,進(jìn)而入侵雞的腸道黏膜細(xì)胞。乳酸乳球菌可以作為疫苗的遞送載體,其表達(dá)的目的蛋白和子孢子入侵前分泌的表面蛋白相似,也同樣可激發(fā)有效保護(hù)性免疫應(yīng)答。選擇乳酸乳球菌作為黏膜免疫方面的活載體疫苗已成為目前研究的熱點(diǎn)之一。頂復(fù)門寄生原蟲的頂膜抗原(AMA1)在蟲體入侵宿主細(xì)胞過程中具有重要作用,但關(guān)于雞柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)子孢子頂膜抗原(Et AMA1)的功能報道較少。本研究探索了表達(dá)Et AMA1的重組乳酸乳球菌抗球蟲感染的免疫保護(hù)作用。研究首先將Et AMA1胞外域基因片段(Ecto AMA1)克隆入原核表達(dá)載體p ET-30a(+)中構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET30(a)-EctoAMA1。將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中篩選陽性菌,陽性菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后采用SDS-PAGE和Western blot方法檢測目的蛋白表達(dá)。使用表達(dá)的蛋白對新西蘭白兔進(jìn)行免疫以制備多克隆抗體。應(yīng)用間接ELISA方法檢測制備的抗體效價,并采用Western blot方法檢測多抗的反應(yīng)性。結(jié)果表明,Ecto AMA1基因全長為1269bp,SDS-PAGE和Western blot分析顯示,Ecto AMA1在大腸桿菌中以不溶性包涵體的形式進(jìn)行表達(dá),其表達(dá)的重組蛋白的分了量約為52 k Da。多克隆抗體檢測效價達(dá)到218,Western blot結(jié)果顯示制備的兔抗AMA1多抗能與子孢子反應(yīng)。之后將Ecto AMA1基因克隆入乳酸菌表達(dá)載體p TX8048中,構(gòu)建三種重組陽性質(zhì)粒,即p TX8048-Ecto AMA1、p TX8048-SP-Ecto AMA1和p TX8048-SP-Ecto AMA1-CWA。將鑒定正確的陽性質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入宿主菌L.lactis NZ9000中篩選到可胞內(nèi)、分泌和表面表達(dá)目的蛋白三種陽性菌L.lactis NZ9000/p TX8048-Ecto AMA1、L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1、L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1-CWA。使用終濃度為5 ng/mL的Nisin誘導(dǎo)重組菌后,Western blot方法檢測到Ecto AMA1蛋白可以三種方式在宿主菌內(nèi)表達(dá)。將誘導(dǎo)后5 109 CFU L.lactis NZ9000/p TX8048-Ecto AMA1、L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1、L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1-CWA分別于4~6、17~19、31~33日齡三次口服免疫SPF雛雞。43日齡除PBS組外其他各組分別采取口服方式接種4×104個E.tenella孢子化卵囊。檢測各組雛雞外周血和脾臟中淋巴細(xì)胞的增殖功能變化、外周血中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化,血清抗體Ig G變化、增重變化、盲腸病變計分、OPG及ACI等評價指標(biāo)。結(jié)果顯示,L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1-CWA組免疫保護(hù)效果最好,L.lactis NZ9000/p TX8048-Ecto AMA1組稍優(yōu)于L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1組,三個免疫組各項指標(biāo)均優(yōu)于相應(yīng)對照組;各免疫組淋巴細(xì)胞增殖活性均顯著高于對照組;流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,各免疫組外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞型數(shù)量均高于對照組;ELISA方法檢測血清Ig G結(jié)果顯示,三種重組菌免疫組抗AMA1血清抗體效價三次免疫后持續(xù)升高,42日齡時達(dá)到最高值,對照組未見升高;L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1-CWA組、L.lactis NZ9000/p TX8048-Ecto AMA1組和L.lactis NZ9000/p TX8048-SP-Ecto AMA1組綜合抗球蟲指數(shù)值分別為162.50、155.19和152.45。實驗結(jié)果提示,以乳酸乳球菌為活疫苗載體經(jīng)口服免疫后可以刺激宿主產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答,對抗同源感染可起到一定的保護(hù)作用。研究將為基于Et AMA1的雞球蟲病乳酸菌口服疫苗研制提供重要參考。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S858.31
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本文編號：1138943